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        感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议

        互联网

        9690

        1、 在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管。1支用来转化样品,1支做pUC18对照。同时将NZY+ broth培养基在42°C预热。

        2、 冰上融化感受态细胞。融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管。

        3、 每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME(巯基乙醇)。

        4、 温和转动试管,将细胞在冰上放置10分钟,每2分钟温和转动一下。

        5、 每管细胞加入0.1–50 ng样品DNA (或2 ml连接反应物)(参见DNA 质量与体积说明。)用灭菌dH2O水按1:10稀释对照pUC18 DNA,并取1 ml稀释的pUC18 DNA加入转化细胞。

        6、 温和转动试管,并在冰上放置30分钟。

        7、 试管在42°C水浴热激30秒。热激时间对转化效率极度重要。

        8、 试管冰浴2 分钟。

        9、 每管加入0.9 ml 预热 (42°C) 的NZY+ 肉汤,37°C、225–250 rpm 摇床培养1 小时。.

        10、 取200 ml转化混和物铺带有相应筛选抗生素的LB琼脂糖平板(如果进行颜色筛选还需加入IPTG和X-gal)。pUC18阳性对照则取5 ml 铺氨苄青霉素LB琼脂糖平板。注意:细胞经 1000 rpm离心 10分钟会聚集,应将细胞沉淀用 200 *l NZY+ 肉汤重悬。如果用于铺板的细胞 <100 ml,先将细胞加入200 ml培养基中,然后用灭菌涂布棒铺板。如果采用?100 ml细胞则可以直接铺板。倾斜涂布棒并轻轻拍打,尽量减少涂布棒上的细胞残留。

        11、 37°C培养过夜。颜色筛选请参见以下Blue-White Color Screening的操作指南。

        12、 pUC18阳性对照预计有约250个克隆(?5 × 109 cfu/mg pUC18 DNA)。而样品DNA的转化效率随DNA的量和组成(超螺旋或连接产物)有较大差异,大质粒和非超螺旋DNA往往得到较少的克隆。

        (适用于Stratagene和Novagen化学法制备的感受态细胞)

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