感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议

1、在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底 离心管 .1支用来转化样品,1支做pUC18对照.同时将NZY+ broth培养基在42°C预热.

2、冰上融化感受态细胞.融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管.

3、每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME( 巯基乙醇 ).

4、温和转动试管,将细胞在冰上放置10分钟,每2分钟温和转动一下.

5、每管细胞加入0.150 ng样品 DNA (或2 ml连接反应物)(参见DNA 质量与体积说明.)用灭菌dH2O水按1:10稀释对照pUC18 DNA,并取1 ml稀释的pUC18 DNA加入转化细胞.

6、温和转动试管,并在冰上放置30分钟.

7、试管在42°C水浴热激30秒.热激时间对转化效率极度重要.

8、试管冰浴2 分钟.

9、每管加入0.9 ml 预热 (42°C) 的NZY+ 肉汤,37°C、225�250 rpm 摇床培养1 小时.

10、取 200 ml转化混和物铺带有相应筛选 抗生素 的LB 琼脂糖 平板(如果进行颜色筛选还需加入IPTG和X-gal).pUC18阳性对照则取5 ml 铺氨苄青霉素LB琼脂糖平板.

注意:细胞经 1000 rpm离心 10分钟会聚集,应将细胞沉淀用 200 *l NZY+ 肉汤重悬.如果用于铺板的细胞 <100 ml,先将细胞加入200 ml培养基中,然后用灭菌涂布棒铺板.如果采用100 ml细胞则可以直接铺板.倾斜涂布棒并轻轻拍打,尽量减少涂布棒上的细胞残留.

11、37°C培养过夜.颜色筛选请参见以下Blue-White Color Screening的操作指南.

12、pUC18阳性对照预计有约250个克隆(?5 × 109 cfu/mg pUC18 DNA).而样品DNA的转化效率随DNA的量和组成(超螺旋或连接产物)有较大差异,大质粒和非超螺旋DNA往往得到较少的克隆.