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        水稻种子中蛋白质和淀粉含量的测定

        互联网

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        目的意义:

        水稻是重要的粮食作物之一,其品质优劣是值得人们重视的问题。一个高产水稻品种,往往由于食味差、或营养不丰富,而不受大众的欢迎。因此,在保证高产的同时,还要改善稻米的品质。本实验将测定大米品质的几个重要生化指标,为水稻育种提供理论依据。

        Ⅰ 大米蛋白质含量的测定——考马斯亮兰G—250法

        一、原理

        考马斯亮G—250是一种染料,在游离状态下呈红色,在465nm波长处有最大光吸收。它能与蛋白质稳定结合,结合蛋白质后变为青色,在595nm处有最大吸收,在一定蛋白质浓度范围内(0~1000μg/ml),蛋白质—色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。

        该法反应迅速,蛋白质与考马斯亮兰G—250的结合反应能在2分钟内达到平衡。结合物在室温下1小时内保持稳定,反应非常灵敏,可测出微克级蛋白质含量,是最近新发展起来的一种较理想的蛋白质定量法。

        二、实验材料、仪器及试剂

        1.仪器:
        721型分光光度计 离心机 50ml容量瓶 10ml刻度试管研钵 量筒 移液管

        2.试剂:
        (1)牛血清白蛋白(1000μg/ml):称取100.00mg牛血清白蛋白,溶于100ml蒸馏水中,配制成标准蛋白质溶液。

        (2)考马斯亮兰G-250溶液:称取100ml考马斯亮兰G—250,溶于50ml 90%乙醇中,加入85%(W/V)的磷酸100ml,最后用蒸馏水定容到1000ml,过滤,常温下可放置1个月。

        (3)0.1mol/LnaOH:称取4g氢氧化纳,用蒸馏水溶解,并定容至1000ml。

        3.材料:大米粉

        三、实验方法

        1.标准曲线的制作:

        取6只10ml刻度试管,编号,按下表数据配制牛血清白蛋白标准溶液。准确吸取上述各管溶液0.1ml,对应放于另外6支10ml刻度试管中,加入5ml考马斯亮兰G-250溶液,盖塞,将试管中溶液给向倒转混合,放置2分钟后,用10mm光径的比色杯在595nm波长下比色。以光密度值为纵坐标,以蛋白质浓度值为横坐标,制作出标准曲线。

        2.样品中蛋白质提取:

        (1)准确称取稻米粉0.5克,放入研钵中,加2ml0.1mol/L NaOH,研磨成匀浆,转入到10ml离心管中,再用6ml 0.1mol/ L NaOH分三次洗涤研钵,洗液一并转入10ml离心管中,用玻棒搅拌,放置30分钟,放置过程间断搅动数次。3500rpm离心15分钟,上清液转入50ml容量瓶中,用蒸馏水定容到刻度,摇匀,得碱溶性蛋白。

        (2)将上述沉淀用70%乙醇重复提取,操作步骤同上,得醇溶性蛋白。

        3.测定:

        吸取提取液0.1ml,放入10ml具塞刻度试管中,加5ml考马斯亮兰G-250试剂,混匀,放置2分钟,用10mm光径的比色杯在595nm波长下比色(比色空白用0.1ml蒸馏水代替提取液与5ml考马斯亮兰G-250试剂混合),记录OD值。然后根据所测OD595nm在标准曲线上查出所对应的蛋白质浓度(C)。
        四、结果计算:

        五、注意事项:

        (1)由于此方法十分灵敏,因此,所用器皿必须清洗干净,取样必须准确,否则会造成很大的误差。

        (2)定容时蒸馏水要沿着管壁缓慢加入,以免产生大量气泡,造成定容不准确,实验也会出现误差。

        (3)谷物种子蛋白质主要是谷蛋白和醇溶蛋白,因此,稻米粉蛋白含量应为碱溶性谷蛋白和醇溶性蛋白含量之和。

        Ⅱ 旋光法测定大米总淀粉

        一、原理

        淀粉因含有不对称碳原子,故具有旋光性。在加热条件下,淀粉可分散于稀盐酸溶液中,用磷钨酸沉淀蛋白质等其他旋光物质后,将溶液定容到一定体积。利用旋光仪测定出淀粉溶液的旋光偏振角。根据不同作物淀粉的比旋光度

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