PCR-ASO分型技术标准

1、引物设计由美国Perkin-elmer公司合成，引物末端标记有生物素

（1）扩增体系

10×PCR buffer 5μl

PCR引物 10μl

4×dNTP 10μl

Taq polymerase 0.25μl

DNA模板 10μl

D、W 14.75μl

Total 50μl

（2） 扩增程序（选用PE9600扩增仪）

变性 95℃ 30Sec

退火 63℃ 30Sec 32个循环

延伸 72℃ 30Sec

最后 72℃延伸10min

注意：扩增过程各设置阳性、阴性质控扩增。

2、扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测

（1） 配制2%琼脂糖凝胶：4g琼脂糖溶于200ml×TBE缓冲液，微波炉中煮沸溶化使透明，冷却至60℃时加入10μl EB混匀；

（2） 将现配制好的琼脂糖溶化凝胶液灌入制胶模具，室温放置30分钟，使其冷却固化；

（3） 小心取出加样梳将已制好的凝胶放入水平式潜水电泳槽中，加1×TBE缓冲液使电极液高出胶面约1cm；

（4） 将标准DNA分子量Marker和DNA参照物，置于干热器孵育5分钟；

（5） 将DNA分子量Marker可见性DNA参照物及待测扩增样品5μl与上样缓冲液（loading buffer溴酚兰-二甲苯青兰）2μl混合后，按照从左向右顺序依次加入凝胶上样孔中；

（6） 150V电压电泳45分钟；

（7） 将电泳完毕的凝胶放置于紫外分析仪上，观察结果并照像，并与标准品对照，观察扩增效果。

3、LDLR、GYPA、HBGG、D7S8和GC五位点DNA杂交

（1） 流程示意：扩增DNA与固定在探针第六上的DNA探针杂交→洗涤除去非特异杂交的扩增DNA→HRP→SA与特异杂交的PCR产物结合→严格洗涤除去非特异结合的HRP-SA；

（2） 主要配制试剂

20×SSPE buffer(3.6M NaCl,200mM NaH2PO4·2H2O 20mM EDTA PH7.4)。

20% SDS

Hybridization Solution(5×SSPE,0.5% SDS)

Wash Solution(2.5×SSPE,0.1%SDS)

Enzyme Conjugate:HRP-SA

Chromogen:TMB Solution

（3） 探针设计：由美国Perkin-Elmer公司合成已制备成探针条。

4、操作步骤

（1） 准备

①打开干热器调温度至95℃；

②调节恒温水浴摇床温度至55.5℃，检查水量是否适合，放入H、S和W、S；

③95%乙醇清洗实验台面以及所以器械；

④用铅笔标记探针条。

（2）步骤（以一个样本为例）

①扩增DNA 95℃变性10分钟；

②每个杂交槽中加入3.0ml H、S加入2μl 变性的扩增DNA，放入标记探针条（此步骤需在20秒内完成），55.5℃恒温水浴摇床孵育15分钟；

③弃去H、S，加5.0mlW、S洗数秒，弃去W、S；

④加3.0ml E、C、S液（3.0ml Hybridizition Solution,25μl Enzyme Corjugate:HRP-SA）,55.5℃孵化5分钟，弃去E、C、S液；

⑤加5.0ml W、S洗涤数秒，弃去W、S；

⑥加5.0ml W、S，55.5℃恒温水浴摇床洗涤12分钟，弃去W、S；

⑦加5.0ml W、S，洗涤数秒，弃去W、S；

注意：杂交缓冲液和洗液使用前固体成份必须55.5℃水浴完全溶解并混匀。

5、显色、判读结果并折照

（1） 主要配制试剂

①Citrate buffer (0.1M Trisodium Citrate PH5.0)

②Color Development Solution(用前10分钟内配制)

5.0ml Citrate buffer

5.0μl 3% Hydrogen Peroxide

0.25ml Chromogen:TMB Solution

（2） 操作步骤

①5.0ml Citrate buffer于杂交槽，置Rocker platform上室温振荡5分钟，弃去Citrate buffer；

②加5.0ml新配制Color Development buffer于每一杂交槽内，置杂交槽于Rocker platform上室温振荡20-30分钟（此步应蔽光）；

③停止显色，弃去Color Development buffer,每槽内加5.0ml去离子水或蒸馏水，置于Rocker platform上室温振荡5-10分钟；

④重复步骤3）至少两次，以降低探针条背景颜色；

⑤将湿的已有分型结果DNA探针条置平滑黑色物体表面，观察判读结果并拍照。