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        凝胶层析

        互联网

        7662

        凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多,如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广,商品名是sephadex型号很多,从G10到G200,它的主要应用范围是:

        ①分级分离各种抗原与抗体;

        ②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片;

        ③分析血清中的免疫复合物;

        ④分子量的测定。

        (一)原理

        凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质,当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时,由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢,在缓冲液洗脱时,分子量大的物质不能进入凝胶孔内,而在凝胶间几乎是垂直的向下运动,而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行,这样就可以按分子量的大小,先后流出凝胶柱,达到分离的目的。

        (二)葡聚糖凝胶的种类与性能

        葡聚糖又名右旋糖酐,在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性,交联度大,吸水性小,相反交联度小,吸水性大。商品名以SephadexG表示,G值越小,交联度越大,吸水性越小,G值越大,交联度越小,吸水性就越大,二者呈反比关系,G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。

        表1-8 Sephadex1的种类与特性

        型号

        分离范围

        (分子量)

        吸水量

        (ml/g)

        最小溶胀时(h)

        20℃~25℃100℃

        床体积(ml)/干凝胶(mg)

        G10

        <700

        1.0±0.1

        3 1

        2~3

        G15

        <1 500

        1.5±0.2

        3 1

        2.5~3.5

        G25

        <5 000

        2.5±0.2

        3 1

        4~6

        G50

        1500~20 000

        8.0±0.3

        3 1

        9~11

        G75

        3 000~70 000

        7.5±0.5

        24 1

        12~15

        G100

        4 000~15 000

        10.0±1.0

        72 1

        15~20

        G150

        5 000~800 000

        15.0±1.5

        72 1

        20~30

        G200

        5 000~30 0000

        20.0±2.0

        72 1

        30~40

        G25、G50有四种颗粒型号:粗(100µ~300µ)、中(50µ~150µ)、细(20µ~80µ)和超细(10µ~40µ)。G75~G200又有两种颗粒型号:中(40µ~120µ),超细(10µ~40µ)。颗粒越细,流速越慢,分离效果越好。

        表1-9 DEAE-纤维素与Sephadex1比较

        项 目

        DEAE纤维素

        Sephadex

        交换量

        较大

        非特异性吸附

        较大

        分离纯度

        较好

        分离时间

        较粗

        较长

        应用范围

        较窄

        较宽

        预处理

        繁琐

        方便

        (三)试验方法

        1.凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶,如除盐和除游离的荧光素,则可选用粗、中粒度的G28或G500,G250多用于分离蛋白质单体,G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。

        2.凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱(或室温)中充分膨胀,或在沸水中煮,膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定(见表1-10)。

        表1-10 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量

        层析柱规格

        凝胶的规格和用量(g)

        直径(cm)

        高(cm)

        容量(ml)

        G25

        G50

        G100

        G200

        0.9

        15

        9.5

        2.5

        1

        0.6

        0.3

        0.9

        30

        19

        5

        2

        1.2

        0.6

        0.9

        60

        38

        10

        4

        2.5

        1.2

        1.6

        20

        40

        10

        4

        2.5

        1.2

        1.6

        40

        80

        20

        8

        5.0

        2.4

        1.6

        70

        140

        35

        14

        9.0

        4.4

        1.6

        100

        200

        50

        20

        12.5

        6

        2.6

        40

        210

        50

        20

        12

        7

        2.6

        70

        370

        90

        35

        20

        12

        2.6

        2.6

        100

        60

        530

        1 000

        130

        250

        50

        110

        30

        70

        17

        35

        为使粒子均匀一致需进行浮选,即加入凝胶粒子后,轻轻搅拌,静置20min,倾去沉淀的粒子,如此反复数次即可。

        3.装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25~100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4~10倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5~1︰25;对于纯化蛋白质来说应为1︰20~1︰100。

        装柱过程基本同离子交换层析柱。

        4.加样与洗脱 样品体积不宜过多,最好为床体积的1%~5%,最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大,浓度过大粘度大,分离效果差,一般不超过4%。

        洗脱液应与膨胀一致,否则更换溶剂,凝胶体积会发生变化,影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液(0.14Mol/L NaCl)。

        5.洗脱液收集 同离子交换层析。

        6.凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后,即可加入新的样品,继续使用。保存方法有三种:

        ⑴ 在液相中保存最方便,即于凝胶悬液中加入防腐剂(一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰)或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

        ⑵ 用完后,以水冲洗,然后用60%~70%酒精液冲洗,凝胶体积缩小,即在半收缩状态下保存。

        ⑶ 长期不用者,最好以干燥状态保存,即水洗净后,用含乙醇的水洗,逐渐加大乙醇用量,最后用95%的乙醇洗,可全部去水,再用乙烯去除乙醇,抽滤干,于60℃~80℃干燥后保存。

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