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        凝胶层析技术

        互联网

        1970
        凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤。具有分子筛作用的物质很多,如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广,商品名是sephadex型号很多,从G10 到G200 ,它的主要应用范围是:①分级分离各种抗原与抗体;②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片;③分析血清中的免疫复合物;④分子量的测定。
        (一)原理
        凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质,当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时,由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢,在缓冲液洗脱时,分子量大的物质不能进入凝胶孔内,而在凝胶间几乎是垂直的向下运动,而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行,这样就可以按分子量的大小,先后流出凝胶柱,达到分离的目的。
        (二)葡聚糖凝胶的种类与性能
        葡聚糖又名右旋糖酐,在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性,交联度大,吸水性小,相反交联度小,吸水性大。商品名以SephadexG表示,G值越小,交联度越大,吸水性越小,G值越大,交联度越小,吸水性就越大,二者呈反比关系,G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。
        表 Sephadex1的种类与特性
        型号
        分离范围
        (分子量)
        吸水量
        (ml/g)
        最小溶胀时(h)
        20℃~25℃ 100℃
        床体积(ml)/干凝胶(mg)
        G10
        <700
        1.0±0.1
        3 1
        2~3
        G15
        <1 500
        1.5±0.2
        3 1
        2.5~3.5
        G25
        <5 000
        2.5±0.2
        3 1
        4~6
        G50
        1500~20 000
        8.0±0.3
        3 1
        9~11
        G75
        3 000~70 000
        7.5±0.5
        24 1
        12~15
        G100
        4 000~15 000
        10.0±1.0
        72 1
        15~20
        G150
        5 000~800 000
        15.0±1.5
        72 1
        20~30
        G200
        5 000~30 0000
        20.0±2.0
        72 1
        30~40
        G25 、G50 有四种颗粒型号:粗(100µ~300µ)、中(50µ~150µ)、细(20µ~80µ)和超细(10µ~40µ)。G75 G200 又有两种颗粒型号:中(40µ~120µ),超细(10µ~40µ)。颗粒越细,流速越慢,分离效果越好。
        表 DEAE-纤维素与Sephadex1比较
        项 目
        DEAE纤维素
        Sephadex
        交换量
        较大
        非特异性吸附
        较大
        分离纯度
        较好
        分离时间
        较粗
        较长
        应用范围
        较窄
        较宽
        预处理
        繁琐
        方便
        (三)试验方法
        1.凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶,如除盐和除游离的荧光素,则可选用粗、中粒度的G28 或G500 ,G250 多用于分离蛋白质单体,G200 多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。
        2.凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱(或室温)中充分膨胀,或在沸水中煮,膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。
        表 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量
        层析柱规格
        凝胶的规格和用量(g)
        直径(cm)
         
        高(cm)
         
        容量(ml)
         
        G25
        G50
         
        G100
         
        G200
        0.9
        15
        9.5
        2.5
        1
        0.6
        0.3
        0.9
        30
        19
        5
        2
        1.2
        0.6
        0.9
        60
        38
        10
        4
        2.5
        1.2
        1.6
        20
        40
        10
        4
        2.5
        1.2
        1.6
        40
        80
        20
        8
        5.0
        2.4
        1.6
        70
        140
        35
        14
        9.0
        4.4
        1.6
        100
        200
        50
        20
        12.5
        6
        2.6
        40
        210
        50
        20
        12
        7
        2.6
        70
        370
        90
        35
        20
        12
        2.6
        2.6
        100
        60
        530
        1 000
        130
        250
        50
        110
        30
        70
        17
        35
        为使粒子均匀一致需进行浮选,即加入凝胶粒子后,轻轻搅拌,静置20min,倾去沉淀的粒子,如此反复数次即可。
        3.装柱 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25~100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4~10倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5~1︰25;对于纯化蛋白质来说应为1︰20~1︰100。
        装柱过程基本同离子交换层析柱。
        4.加样与洗脱 样品体积不宜过多,最好为床体积的1%~5%,最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大,浓度过大粘度大,分离效果差,一般不超过4%。
        洗脱液应与膨胀一致,否则更换溶剂,凝胶体积会发生变化,影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液(0.14Mol/L NaCl)。
        5.洗脱液收集 同离子交换层析。
        6.凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后,即可加入新的样品,继续使用。保存方法有三种:
        ⑴ 在液相中保存最方便,即于凝胶悬液中加入防腐剂(一般为0.02%N2 N3 或0.002%洗必泰)或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。
        ⑵ 用完后,以水冲洗,然后用60%~70%酒精液冲洗,凝胶体积缩小,即在半收缩状态下保存。
        ⑶ 长期不用者,最好以干燥状态保存,即水洗净后,用含乙醇的水洗,逐渐加大乙醇用量,最后用95%的乙醇洗,可全部去水,再用乙烯去除乙醇,抽滤干,于60℃~80℃干燥后保存。

         

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