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        NK细胞活性测定:同位素法

        互联网

        4906

        一、原理

        将用同位素3H-TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时,靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来,其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞3H-TdR的释放率即可反应NK细胞的活性。

        二、仪器和材料

        液体闪烁仪、多头细胞取集器、二氧化碳培养箱、3H-TdR、RPMI1640 完全培养液、Hank's液(pH7.2~7.4)、YAC-1细胞、Triton X-100

        三、实验步骤

        1、靶细胞的标记

        取传代后24h生长良好的YAC-1细胞(存活率>95%)按1×106/mL YAC-1细胞悬液加3H-TdR 10uCi进行标记,于37℃、5%CO2培养箱中培养2h,每30min振荡1次。标记后的细胞用培养液洗涤3次,重悬于培养液中,使细胞浓度为1×105个/mL。

        2、脾细胞悬液的制备(效应细胞)

        无菌取脾,置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中,用镊子轻轻将脾撕碎,制成单细胞悬液。经200目筛网过滤,用Hank's液洗3次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×107个/mL。

        3、NK细胞活性测定

        在96孔培养板中每孔加100μL标记的靶细胞,实验孔加100μL效应细胞,空白对照孔加100μL培养液,最大释放孔加100μL 2.5% Triton X-100。每个样品设3个复孔,置5%CO2、37℃培养箱内温育4h,用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上,用液体闪烁仪进行测量。

        按下式计算NK细胞活性:

        实验孔cpm

        NK细胞活性(%)=(1- ──────────────────) ×100%

        空白对照孔cpm - 最大释放孔cpm

        4、数据处理及结果判定

        NK细胞活性需进行数据转换,X=Sin-1 ,式中P为NK细胞活性,用小数表示。在进行方差分析时,需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值< F0.05,结论:各组均数间差异无显著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计;对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换,待满足正态或方差齐要求后,用转换后的数据进行统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的,改用秩和检验进行统计。

        受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性,可判定该项实验结果阳性。

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