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        Western Blot,如何成功优化?

        优宁维

        7591

        Western Blot 现在仍然是检测和分离蛋白最常用的一种实验方法,但是要想得到较好的结果并不容易,只有找到合适的实验条件并进行优化,才能以更少的时间得到更多的结果,达到事半功倍的效果!下面是 R&D Systems 品牌为您推荐的免疫印迹优化步骤和实验涉及参考数据:

        一抗浓度对实验结果的影响

        抗体:Human/Mouse/Rat RSK1 Antibody (Catalog # AF992)

        样本:人 HeLa 细胞 (Fig.1)

        A:5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        B:5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.2 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        Western Blot,如何成功优化?

        Fig.1

        脱脂奶粉及 NaCl 浓度对实验结果的影响

        抗体:Human PTP1B Antibody (Catalog # AF1366)

        蛋白分离:人 HeLa 细胞 (Lane 1),MCF-7 (Lane 2) 和 TF-1 (Lane 3)(Fig.2)

        A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉和 0.15 M NaCl

        B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15 M NaCl

        C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5 M NaCl

        Western Blot,如何成功优化?

        Fig.2

        一抗浓度、一抗溶液中脱脂奶粉含量及印迹缓冲液中 NaCl 浓度对实验结果的影响

        抗体:Human PTP1B Antibody (Catalog # AF1366)

        2% 脱脂奶粉溶液中一抗浓度对实验结果的影响 (Fig.3):

        A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.3 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.1 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        Western Blot,如何成功优化?

        Fig.3

        5% 脱脂奶粉溶液中一抗浓度对实验结果的影响 (Fig.4):

        A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.3 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.1 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        Western Blot,如何成功优化?

        Fig.4

        印迹缓冲液中 NaCl 浓度对实验结果的影响 (Fig.5):

        A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl

        B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0. 5 M NaCl

        Western Blot,如何成功优化?

        Fig.5

        印迹溶液中 NaCl 浓度对实验结果的影响

        抗体:Human/Mouse/Rat RSK1 Antibody (Catalog# AF992)

        样本:人 HeLa 细胞 (Fig.6)

        A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15 M NaCl

        B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5 M NaCl

        Western Blot,如何成功优化?

        Fig.6

        我们为您推荐实验设计数据参考:

        裂解缓冲液

        蛋白定位

        裂解液

        推荐试剂盒

        全细胞

        NP-40 or RIPA

        全蛋白抽提试剂盒

        细胞质(可溶蛋白)

        Tris-HCl

        胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒

        线粒体蛋白提取试剂盒

        细胞质(细胞骨架 等不溶蛋白)

        Tris-Triton

        蛋白分级抽提试剂盒

        细胞膜

        NP-40 or RIPA

        膜蛋白抽提试剂盒

        蛋白分级抽提试剂盒

        细胞核

        RIPA

        核蛋白抽提试剂盒

        线粒体

        RIPA

        线粒体蛋白抽提试剂盒

        亚细胞定位蛋白抽提试剂盒

        蛋白酶磷酸酶抑制剂

        抑制剂

        蛋白酶或磷酸酶

        PMSF

        丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶

        Leupeptin 亮肽素

        抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶,如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B

        Aprotinin 抑肽酶

        丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X

        Pepstatin 胃蛋白酶抑制剂

        抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳 酶、许多微生物酸性蛋白酶

        EDTA-Na2

        金属蛋白酶抑制剂

        NaF氟化钠

        丝氨酸、苏氨酸磷酸酶

        Na3VO4原矾酸钠

        酪氨酸磷酸酶

        电泳凝胶的制备

        蛋白分子量 (kDa)

        凝胶浓度 (%)

        4-40

        20

        12-45

        15

        10-70

        12.5

        15-100

        10

        25-200

        8

        内参对照

        内参名称

        分子量大小

        适用范围

        Beta-actin

        43kDa

        胞浆和全细胞

        GAPDH

        30-40kDa

        胞浆和全细胞

        Tubulin

        55kDa

        胞浆和全细胞

        VCDA1/Porin

        31kDa

        线粒体

        COXIV

        16kDa

        线粒体

        Lamin B1

        16kDa

        细胞核(不适于去除核膜的样本)

        TBP

        38kDa

        胞浆和全细胞

        转膜


        PVDF 膜

        NC 膜

        尼龙膜

        灵敏度和分辨率

        背景

        较高

        蛋白结合能力

        100-200μg/cm2 (适用于SDS 存在时与蛋白结合)

        80-100μg/cm2

        大于400μg/cm2

        机械强度

        干的膜易脆

        软而结实

        溶剂抗性

        浸润

        100% 甲醛

        缓冲液

        缓冲液

        适用染色方法

        胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁

        胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁

        不能用阴离子染料

        适用检测方法

        显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测

        显色法、化学发光、荧光、放射性

        显色法、化学发光、放射性

        适用范围

        普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测

        普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1μm膜适用于70KDa以下蛋白

        低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用

        价 格

        较低

        显色

        底物

        DAB

        4-CN

        AEC

        TMB

        稳定性

        一般

        避光

        灵敏度

        250pg

        1ng


        100pg

        背景

        一般

        终产物成像性

        成像较难

        容易成像


        容易成像

        颜色

        褐色

        介于蓝色与蓝紫色之间(可用于双染)

        棕红色

        蓝紫色

        毒性

        有(疑有治癌作用)

        选择 R&D Systems 抗体的四大理由:

        Purification-采用抗原亲和纯化的方式对抗体进行纯化,纯化后的抗体具有更好的特异性;

        Antigens-使用重组蛋白作为制备抗体的免疫原,大大提高了抗体对抗原的特异性识别能力;

        Specificity-批次间稳定性的严格控制,有效保证了 R&D Systems 目录抗体在识别抗原时的特异性;

        Source-多种宿主来源,以及多种单抗或多抗的选择,为客户提供了更丰富、更贴心的选择。

        上海优宁维生物科技股份有限公司

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