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        免疫荧光组织(细胞)化学染色方法:间接法

        互联网

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        一、原理与意义

        免疫荧光组织(细胞)化学染色方法——间接法,是一种荧光抗体染色法。该方法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原,敏感性较高,操作方法较易掌握,而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的研究和检查,所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。

        二、操作流程

        (一)双层法(Double Layer Method)

        1、切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min。然后用0.01mol/L pH7.2 PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体。

        2、再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。

        3、对照染色

        ①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。

        ②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。

        ③阳性对照。

        (二)夹心法:未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下:

        1、切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。

        2、滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。

        3、缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干。

        4、滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃,30min。

        5、如③水洗。

        6、缓冲甘油封固,镜检并拍照。

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