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        🔥 双重染色法免疫荧光组织化学染色

        相关实验:免疫荧光技术

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 孙齐博士

        生理学 首都医科大学

        简介

        若在同一标本中有 A 和 B 两种抗原需要同时显示,A 抗原的抗体用 FITC 标记,B 抗原的抗体用 TRITC 标记,可采用免疫荧光细胞化学双重染色法。

        材料与仪器

        原代培养胚胎,14 天大鼠端脑细胞,FITC,TRITC

        步骤

        原代培养胚胎 14 天大鼠端脑细胞:在骨发生形态蛋白的诱导下,乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白 Islet―1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共聚焦显微镜观察)。

        1、一步双染色法先将两种荧光标记抗体按适当比例混合(A + B),按直接法进行染色。

        2、二步双染色法先用 TRITC 标记的 A 抗体进行免疫荧光染色,再用 FITC 标记的 B 抗体染色,根据两种抗体的动物种属不同,可用直接法也可用间接法,结果 A 抗原呈现橘红色荧光,而 B 抗原呈现黄绿色荧光。在应用中,常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和 SABC-Cy3 法相结合。

        例如,在实验设计时,选择小鼠抗大鼠 A 和兔抗大鼠 B 作为两种不同的特异性一抗,相匹配的二抗分别为 FITC-抗小鼠 IgG 和生物素化―抗兔 IgG。进行双重染色时,由于两种一抗种属来源不同,可把一抗混合使用。

        孵育结束后洗涤未结合的一抗,滴加二抗时,先加人生物素化―抗兔 IgG(二抗)孵育,洗涤后,滴加 SABC-Cy3 复合物,经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光,再进行 FITC―抗小鼠 IgG(二抗)的孵育,最后封片观察。其结果 A 抗原呈现绿色荧光,B 抗原呈现红色荧光。

        注意事项

        双重染色法免疫荧光组织化学染色应注意两种一抗在混合稀释时,抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之,混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。若两种一抗种属来源相同,必须分两次进行双重染色,即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对 A 抗原进行染色,洗涤后,用第二种一抗和第二种荧光二抗对 B 抗原进行染色,否则会出现交叉反应而使染色无特异性。

        来源:丁香实验

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