大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存

大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种受体菌，它的遗传背景研究的比较详细，常用做寄主进行基因扩增及外源基因的表达。

一. 实验目的 :

掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。

二. 实验原理 :

大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(Plasmid)DNA，这是一种双链闭合环状的DNA分子，大小在1Kb-200Kb左右，通常质粒DNA带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些表现型:

1．对抗生素的抗性 2．产生抗生素 3．降解有机复合物

4．产生大肠杆菌素 5．产生内毒素 6．产生限制修饰酶

三．实验材料 :

　E．coli InvaF ' E．coli InvaF ' (pUC19)

四．实验 仪器 、器皿及试剂:

仪器 : 超净工作台 恒温培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 微波炉等

器皿: (见附录)

五．实验步骤 :

1. 配制培养基：

ａ．LB(Lurib-Bertani) media

酵母抽提物 (Yeast extract) 5g/L

胰蛋白胨 (trytone) 10g/L

Nacl 10g/L

加 蒸馏 水定容至1000ml调节pH值至7.0。

配制750ml固体培养基: 在上述液体培养基中，按15 g/L加入 琼脂 加热至充分熔化，即成固体培养基。

ｂ：50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddH 2 O至100ml。

将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒15磅20min

2. 倒平板:将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至50℃以下凝固前，加入Amp至100ug/ml摇动混匀，每平皿倒入25ml左右，此过程应进行无菌操作，另倒一不含Amp的LB平板。

第一次划线后接种环灼烧 第二次划线起点与第一次　　 如此在平板上

再进行第二次划线 　 划线交，接种环灼烧后再 划线5-6次

4. 接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜，运用这种划线方法接种，可以较好地保证单菌落的形成。

5. 比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:E.coli InvaF ' E.coli InvaF ' (pUC19)的单菌落分别接种至含Amp和不含Amp的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。