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        PCR-SSCP原理和操作步骤

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        9732

        原理

        PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。

        PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA,单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象,其构象直接影响泳动速率,相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别,就可以产生立体构象的不同,造成泳动速率的不同,产生不同的泳动带。

        PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳,与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。

        为了便于观察分析结果,PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物,电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带,此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤,但其灵敏度不如用同位素标记。

        单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关,但也受到其他条件的影响。因此,PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件,如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。

        PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性,一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。

        步骤

        1. PCR反应(同前)

        PCR产物经琼脂糖电泳确认。

        2. PCR反应结束后,取5μl扩增产物加10μl甲酰胺上样缓冲液混匀,98℃ 变性10分钟,迅速冰浴。

        3. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

        (1)制备50 ml 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶,加 TEMED 25 μl、10%过硫酸铵250 μl,混匀后灌胶,插入加样梳子。待胶完全聚合后,拔出加样梳子,安装电泳装置,加入1´TBE电泳缓冲液,缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。

        (2)取已变性的5 μl PCR扩增产物加到点样孔中,以20 V/cm 电泳 4~5小时。

        (3)拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶,放到一个塑料盘内,用蒸馏水冲洗1~2遍。

        (4)倒入固定液,固定 8~10分钟。

        (5)用蒸馏水冲洗1~2遍;倒入银染液,银染10~12分钟。

        (6)用蒸馏水冲洗若干遍;倒入显色液,显色至出现清晰的银染带。

        (7)用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶,观察PCR-SSCP结果。

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