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        RNA的甲醛变性电泳

        相关实验:RNA 的甲醛变性电泳实验

        最新修订时间:

        原理

        用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA分子大许多,电泳迁移率低;而RNA中以rRNA最多,占到80%~85%,tRNA及核内小分子RNA占15%~20%,mRNA占1%~5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带。mRNA因量少且分子大小不一,一般是看不见的。故可通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果。
         

        材料与仪器

        步骤

        一、材料、试剂和仪器
         
        1.  材料:植物总RNA 5-10 ug
         
        2.  试剂
         
        (1)加样运载缓冲液(Loading buffer)
        50% 甘油
        1 mmol/L EDTA (pH8.0)
        0.25%溴酚蓝
        25%二甲苯氰FF
         
        (2)10xTAE Buffer
         
        (3)5x甲醛凝胶电泳缓冲液:
        0.1 mol/L MOPs (pH7.0)
        40 mmol/L乙酸钠
        5 mmol/L DETA(pH8.0)
         
        (4)甲醛,甲酰胺
         
        3.  仪器:电泳装置,紫外透射观测仪
         
        二、实验程序
         
        1.  甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制
         
        在250 mL的锥形瓶中准确称量2 g Agarose (Sigama),再加20 mL 10xTAE Buffer,144 mLDEPC处理过的双蒸水,微波炉中化胶,待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5 ug/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛,放置一段时间以减少甲醛蒸汽。
         
        2.  RNA的甲醛变性电泳
         
        (1) 样品制备
        RNA总量:10 ug
        5×甲醛凝胶电泳缓冲液:4 ul
        甲醛: 3.5 ul
        甲酰胺:10 ul
        加入无菌离心管中混合,95℃水浴变性2 min(或55℃,15 min),取出后放入冰中冷却。
         
        (2) 加入2 ul无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度,以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,便于加样操作;能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时,溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同,而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4 kb 的双链线状DNA相同。)
         
        (3)将胶板浸没在1x甲醛凝胶电泳缓冲液中,点样前5 V/cm预跑5 min。点样后3-4 V/cm电泳。
         
        (4)电泳结束后(溴苯酚蓝迁移到约8 cm处),紫外灯下观察, 照相。
         

        注意事项

        每一泳道至多可分析30mg RNA,通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交,可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1%以上);如待测RNA含量极微,每个泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。

        常见问题

        每一泳道至多可分析30mg RNA,通常用10-20mg总RNA进行Northern杂交,可以检测高丰度mRNA(占mRNA总量的0.1%以上);如待测RNA含量极微,每个泳道加0.5-3.0mg poly(A) RNA。


        来源:丁香实验

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