五种致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测试剂盒

                                              五种致泻大肠埃希氏菌多重荧光定量PCR试剂盒

产品及特点：
感染性腹泻是全球性的公共卫生问题，WHO预计每年全球腹泻发病高达30亿～50亿人次，每年死于腹泻的患者达500万。致病性大肠埃希氏菌是感染性腹泻重要病原之一，据文献报道2009—2013年我国16个省市分离自社区获得性细菌性腹泻患者的致泻性大肠埃希氏菌为3.13%，排在第四位。根据其致病机制不同，主要有五种类型：肠产毒性大肠杆菌（ETEC）、肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠粘附性大肠杆菌（EAEC），统称为致泻性大肠杆菌（enterovirulent  E.coli）。肠道致病性大肠埃希氏菌：能够引起宿主肠黏膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤,且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌。该菌是婴幼儿腹泻的主要病原菌,有高度传染性,严重者可致死。肠道侵袭性大肠埃希氏菌：能够侵入肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌。该菌无动力、不发生赖氨酸脱羧反应、不发酵乳糖,生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌。产肠毒素大肠埃希氏菌：能够分泌热稳定性肠毒素或/和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌。该菌可引起婴幼儿和旅游者腹泻,一般呈轻度水样腹泻,也可呈严重的霍乱样症状,低热或不发热。因此，快速便捷检测致病性大肠埃希氏菌具有重要意义，本产品根据荧光定量PCR原理开发的试剂盒。

检验原理：

五种致泻大肠埃希氏菌(DEC)多重荧光定量PCR试剂盒采用3个反应管检测样本中的12种基因，包括eae、stx1、stx2、bfpB、elt、stIa、stIb、aggR、pic、astA、ipaH和uidA基因，根据毒素基因确定五种致泻性大肠杆菌型别。本试剂盒采用多重PCR结合Taqman技术，依据病原体的特异性基因设计引物探针。利用荧光定量PCR仪在PCR过程中相应通道信号进行实时监测和输出，分析根据毒力基因的种类并确定毒株的致病型别。

【储存条件及有效期】

低温运输、-20℃±5℃避光保存、反复冻融少于7次，有效期 12个月。

【适用仪器】

ABI系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

1. 样品选择：大肠埃希氏菌感染多与肠道相关，因此常见的样本有粪便、尿液、血液等，采集时应根据具体的临床情况选择合适的样本进行检测。

2. 无菌操作：采集样本时应注意无菌操作，避免外界细菌污染。

3. 存放：样本在2~8℃条件下保存应不超过72h，-70℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。

【检验方法】

1. 样品处理（样本处理区）

我们建议使用商品化的试剂盒提取DNA，严格按照对应试剂盒说明书操作，样本核酸提取过程种应避免污染。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照；样品每满10份，多配制1份)，每测试反应体系配制如下表：

A孔位配制组分	反应体积
致泻大肠杆菌引物混合液-A	3μl
探针法qPCR酶混合液	3μl
探针法qPCR反应液	14μl
总体积	20μl

 

B孔位配制组分	反应体积
致泻大肠杆菌引物混合液-B	3μl
探针法qPCR酶混合液	3μl
探针法qPCR反应液	14μl
总体积	20μl

 

C孔位配制组分	反应体积
致泻大肠杆菌引物混合液-C	3μl
探针法qPCR酶混合液	3μl
探针法qPCR反应液	14μl
总体积	20μl

3. 加样（样本处理区）

将步骤1提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取5μl，分别加入3个对应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM，VIC/HEX，ROX，Cy5， 淬灭通道NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。

推荐循环参数设置：

 

注：ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正，设置淬灭基团选择None。

5. 结果分析判定：

根据下表中12种毒力基因对应荧光通道检测结果判断：

孔位	FAM荧光通道	HEX荧光通道	Cy5荧光通道	ROX荧光通道
A	stx1	Stx2	eae	bfpB
B	elt	ipaH	stIa	stIb
C	uidA	aggR	pic	astA

1.实验有效性判定：

（1）阳性对照：FAM、VIC、CY5和ROX通道有S型扩增曲线，阳性对照Ct值≤35。

（2）阴性对照：FAM、VIC、CY5和ROX通道无S型扩增曲线，Ct值＞38或无Ct值。

2.毒力基因结果判定：

（1）阳性：扩增曲线呈S型，且检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线；

（2）可疑：扩增曲线呈S型，且检测通道 35.0

（3）阴性：标本检测结果Ct值＞38或无Ct值。

3.致病型别判定：

致泻大肠埃希氏菌类别	阳性结果判断组合
EPEC	bfpB（+/-),eae（+),stx1（-),stx2（-)	uidA（+/-)
STEC/EHEC	stx1、stx2中一条或以上阳性，eae（+/-)，bfpB（-)
ETEC	elt、stIa、stIb中一条或以上阳性
EIEC	ipaH（+)
EAEC	aggR、pic、astA中一条或以上阳性

1、97%以上大肠埃希氏菌为uidA阳性，可参考阴性对照中该基因检测结果判断。

2、当结果判定为EPEC阳性时，若bfpB靶标为阳性则说明样品中含有典型的EPEC；若bfpB靶标为阴性则说明样品中含有非典型的EPEC。

3、当结果判定为STEC/EHEC阳性时，若eae靶标为阳性则说明样品中含有典型的EHEC；若eae靶标为阴性则说明样品中含有非典型的EHEC。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行，PCR操作各阶段应严格分区操作，避免交叉污染。

2.为避免DNA降解，样本处理过程应在0-4℃条件下操作，且完成实验后立即上机检测；样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。

3.每次实验应该设置阴、阳性对照。

4.试剂盒所有试剂在使用前应该在常温下充分融化混匀，并应瞬时离心。

5.试剂盒内所配阴性和阳性对照在第一次使用前应全部转移至标本准备区，并单独存放。

6.为防止荧光干扰，应避直接接触PCR反应管，并应避免在PCR反应管上进行任何标记。

7.仪器扩增相关参数应按照本说明书相关要求进行设置；不同批号试剂不能混用。

8.实验过程中产品的废弃物应该进行无害化处理后方可丢弃。