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        正常小鼠原代真皮纤维原细胞培养

        互联网

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        正常 小鼠原代真皮纤维原细胞培养

        一、实验试剂

        1、培养基: PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement

        2、冻存液: PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO

        3、洗涤液: 1 × PBS (pH 7.4 )+ 1% P/S

        4、染色液: 0.4% Trypan Blue

        5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit

        6、检测试剂:抗小鼠Fibronectin抗体,荧光标记二抗,乙醇丙酮混合液(1:1)

        二、实验器械

        1、培养皿

        2、培养瓶

        3、直剪和眼科剪

        4、眼科镊

        5、玻璃滴管

        6、15ml离心管

        7、200目网筛

        三、实验流程

        取材
        取皮片,削成厚度为0.5mm的皮片
        皮片浸泡在75%酒精中消毒
        1 × PBS (pH 7.4 )清洗皮片两遍
        皮片剪成(3-5)mm×(10-15)mm大小
        置于消化液中4℃消化过夜
        剥去表皮,并刮去真皮下的其他组织
        将组织块剪成1mm3 左右
        加入消化液,37℃消化至消化液浑浊
        停止消化,悬液过200目网筛
        收集细胞悬液,800rpm离心5min
        重悬细胞,重复离心一次
        重悬细胞,Trypan Blue染色计数,以5×105 的数量接种于培养瓶中
        37℃,5%CO2 培养

        四、实验操作

        1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶,置于超静台吹干或45℃烘箱烘干(切记保持无菌),4℃冰箱放置,备用。

        2、取材:从小鼠身上取皮片,削成厚度为0.5mm左右的皮片;

        3、材料预处理:将皮片浸泡在75%的酒精中消毒;用1 × PBS (pH 7.4 )清洗两遍(每次约5min)以清除血细胞;

        4、初步消化:将皮片剪成(3-5)mm×(10-15)mm大小,去除皮下组织;将裁剪好的皮块置于消化液中4℃消化过夜;第二天,取出消化好的细胞,用镊子尽可能剥去表皮,并刮去真皮下的其他组织;

        5、再次消化:处理好后,将组织块剪成1mm3 左右,加入消化液,37℃震荡消化至消化液浑浊(1h左右);

        6、中止消化:中止酶反应,悬液过200目网筛;

        7、收集重悬细胞:收集细胞悬液,800rpm离心5min;弃上清,用培养基重悬细胞,重复离心一次;

        8、细胞密度计数:培养基重悬细胞,0.4% Trypan Blue染色计数,以5×105 的数量接种于培养瓶中。

        9、培养:放置于37℃,5% CO2 培养箱中。

        五、细胞鉴定

        1、显微鉴定:相差显微镜下,可见细胞呈梭形或扁的星状,具有突起。细胞具备良好的透光性。

        2、免疫组织化学鉴定 :利用Fibronectin相关抗原检测。

        3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中,接种细胞为3×104 个/孔,48小时候细胞可以长满,用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。

        4、细胞固定:用PBS洗涤细胞,之后放入乙醇丙酮混合液中,固定10min,空气中自然干燥。

        5、特异性抗体:按照说明书稀释比要求稀释抗体,加入抗体,放置37℃孵育60min。

        6、洗涤:1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次 × 15 分钟,晾干。

        7、标记性抗体:加入荧光标记抗体,37℃孵育30min。

        洗涤:1 × PBS (pH 7.4 )洗涤3次 × 15 分钟,晾干。

        8、封片:封片剂封片。

        9、镜检:荧光显微镜下观察。

        六、注意事项

        1、选材注意时要将皮肤组织上的被毛去除干净,也可以使用还未长出被毛的乳鼠进行试验。

        2、注意尽量将皮片剪成(3-5)mm ×(10-15)mm大小,如太大则不利于消化,太小则不利于真皮、表皮的物理分离。

        3、过度消化损伤严重影响成纤维细胞的生长,因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。

        4、严格控制成纤维细胞的培养条件。包括细胞培养用液(培养基,生长因子,血清,抗生素)的质量,浓度。

        5、关于培养瓶包被与否,有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中,可以酌情考虑是否包被。

        6、传代培养细胞接种量为5×104 个(25 cm2 培养瓶),细胞倍增时间为48小时。细胞传代培养最佳为4-7代, 传代次数增加,细胞体积增大,细胞之间间隙增加,细胞贴壁牢固,传代消化时间会有所延长。

        七、 PriCells 细胞图片

        正常小鼠原代真皮纤维原细胞培养

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