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        胚胎鼠成纤维细胞原代培养

        相关实验:原代胚胎成纤维细胞培养

        别名:小鼠/大鼠成纤维细胞原代培养

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 孙汉寅硕士

        生物与医药学 中国科学院大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 李娜硕士

        生理学 大连医科大学

        简介

        细胞培养是模拟机体内生理条件,将细胞从机体内取出,在人工条件下培养,使细胞生存、生长、繁殖和传代,从而可以进行细胞生命过程、细胞癌变等问题的研究。

        原理

        细胞培养是指将细胞从动物或植物体内取出,然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离,也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。包括原代培养和传代培养。


        原代鼠胚胎成纤维(MEF)细胞培养是指从孕鼠中剖取适宜胎龄的胎鼠,采用酶消化法或或组织块贴壁法获得原代胚胎成纤维细胞。

        用途

        1、用于支持干细胞的培养;

        2、进行体外研究;

        材料与仪器

        【材料】:

        DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶(含EDTA)、青霉素-链霉素(双抗)、无菌PBS溶液、怀孕14-15天的母鼠、60mm无菌培养皿、100mm无菌培养皿、无菌离心管;

        【主要仪器】:

        倒置显微镜、二氧化碳细胞培养箱、4℃离心机、高压灭菌的手术器械(包括眼科剪、眼科镊等)。

        步骤

        1、取怀孕14-15的小鼠,采用脱颈椎的方法将小鼠处死,将小鼠浸泡在酒精中2-3nin;

        2、暴露孕鼠腹部皮肤,用眼科剪将剪开腹壁以暴露出子宫角,取出子宫,将其子宫置于装有PBS(含双抗)的的培养皿中,用含有双抗的PBS冲洗3次(冰上操作);

        3、将取出的子宫转移至新的无菌培养皿中(装有预冷的PBS),用眼科剪沿子宫系膜打开子宫,取出带有胎膜的胎鼠,并用两把眼科镊子剔除胎膜,取出胎鼠(冰上操作);

        4、将胎鼠移入新的含预冷的PBS的培养皿中,用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头部、四肢和内脏,得鼠胚躯干(冰上操作);

        5、 将鼠胚躯干转移至含预冷PBS的新的无菌培养皿中,用含双抗PBS洗涤至无肉眼可见的血色(冰上操作);

        6、将上一步获得组织移入另一含预冷DMEM]的培养皿中,剪碎至肉糜状,加入0.25%胰酶,置于37℃细胞培养箱消化15-20min;

        7、15-20min后加入含血清的DEME培养基终止消化;

        8、将200目筛网置于50ml离心上,将细胞悬液滴至筛网上过滤;

        9、将获取滤液转移至15m离心管中,1000r,4℃离心5min;

        10、弃上清,重新加入10%FBS的DMEM培养液,制成细胞悬液;

        11、将悬液接种到预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶中或培养皿,于37℃、5%CO2培养箱中孵育;

        12、4-6小时后观察细胞贴壁情况,更换新鲜培养液;

        注意事项

        1、剖取组织要在冰上操作;

        2、冲洗组织时,用含双抗的PBS洗涤;

        3、成纤维细胞易于贴壁,4小时就可以获得贴壁成纤维细胞;

        常见问题

        1、细胞污染:注意操作过程严格无菌,子宫、胚胎冲洗时用含双抗的PBS;

        2、获取细胞碎片较多:注意消化时间控制,切勿过度消化;

        3、过200目细胞筛网时,悬液难以过滤:组织尽量减至肉糜状、胰酶使用前在37℃水浴锅充分预热;

        来源:丁香实验

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