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        检测未知抗原

        相关实验:标记亲和素生物素法 (BA-ELISA) 实验

        最新修订时间:

        原理

        亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白,对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达1015M-1)。生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒

        步骤

        1.  包被抗体:用0.05 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液将已知抗体作适当稀释,在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1 ml,于4 ℃过夜(18~24 h)。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3 min(简称洗涤,下同)。
         
        2.  加样:加入待检样品(未知抗原)或作适当稀释的标准参考品于反应孔中,同时作空白孔、阴性和阳性孔对照。37 ℃孵育1 h,洗涤。
         
        3.  加B-Ab:已作适当稀释的生物素化抗体(B-Ab),每孔加0.1 ml,37 ℃孵育30~60 min。洗涤。
         
        4.  加A-HRP:已作适当稀释的辣根过氧化物酶标记的亲和素(A-HRP),每孔加0.1 ml,37℃孵育30~45 min。洗涤4次。
         
        5.  底物显色:于上述各反应孔中加入临时配制的TMB(或 OPD)底物应用液0.1 ml,于37 ℃孵育10~30 min。再加2 mol/L H2SO4 0.05 ml以终止反应。
         
        6.  结果判定:目测或在ELISA比色仪上测 OD 值(见ELISA部分)。 

        来源:丁香实验

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