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        交叉保护中和实验

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        3944

        试验目的 血清分型

        标本 出血热恢复期病人血清

        材料

        1、 毒株 汉滩病毒标准株 76-118,汉城病毒标准株 Seoul;

        2、标准血清 兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清;

        3、空斑减少中和试验常用试剂。

        步骤

        1、将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1:10,56℃灭活30分钟;

        2、进一步2倍稀释血清成1:20、1:40、1:80……,对照血清1:10稀释;

        3、稀释两种病毒(在冰浴中进行)至含200pfu/ml;

        4、各连续稀释度血清分别与200pfu/ml的两种病毒液等量混合(各0.3ml),置37℃中作用1小时(每15分钟振荡一次);

        5、吸出各细胞培养孔中维持液;

        6、接种长满单层的Vero-E6细胞(24孔板),每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ,每稀释度两孔,100ul/孔。37℃吸附1小时,每隔15分钟摇动一次;

        7、加第一层琼脂糖覆盖液(需冷置42℃左右),每孔1ml,室温下待凝固,细胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培养7-9天;

        8、加第二层含中性红琼脂糖覆盖液,1ml/孔,室温下待凝固,细胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培养2-5天,从第二天开始观察空斑数;

        9、抗体滴度的判定,以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度;

        10、型别判定:根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分,如果一份血清与汉滩病毒 (或汉城病毒)反应的抗体滴度高于与汉城病毒(汉滩病毒)的抗体滴度4倍或以上,即判为汉滩病毒型,反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时,则不好分型。不足4倍时亦不能定型。

        配方

        1、第一层琼脂糖覆盖液

        2×Eagle MEM液50ml(Gibco-BRL)
        灭活胎牛血清10ml
        L-谷氨酰胺4ml(200mmol/L,100X)
        MEM非必需氨基酸1ml(Gibco,100x)
        1mol/L HEPES缓冲液2ml
        青链霉素1ml(青霉素10000u/ml,链霉素10000ug/ml)
        制霉菌素(一般可以不加)0.1ml
        临用前配制,放入42℃水浴中,另取
        琼脂糖0.6g(Sigma, Type II medium EEO)
        超纯水34ml(适用于细胞培养的纯化水)
        8磅高压灭菌15min,置42℃水浴15min,加入上述配制的组分中,即可使用。

        2、第二层琼脂糖覆盖液 基本上同第一层琼脂糖覆盖液,仅将灭活胎牛血清改为5ml,另加中性红溶液1ml(333.0ug/L中性红钠盐Gibco)。

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