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        交叉保护中和实验

        相关实验:交叉保护中和实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、试验目的

        血清分型。

        二、实验材料准备
         
        1.  标本

        出血热恢复期病人血清

        2.  材料
         
        (1) 毒株 汉滩病毒标准株 76-118,汉城病毒标准株 Seoul;
         
        (2)标准血清 兔抗汉滩病毒、汉城病毒血清;
         
        (3)空斑减少中和试验常用试剂。
         
        三、步骤
         
        1.  将待检血清用牛血清Hanks 氏液稀释成1:10,56℃灭活30分钟;
         
        2.  进一步2倍稀释血清成1:20、1:40、1:80……,对照血清1:10稀释;
         
        3.  稀释两种病毒(在冰浴中进行)至含200 pfu/ml;
         
        4.  各连续稀释度血清分别与200 pfu/ml的两种病毒液等量混合(各0.3 ml),置37℃中作用1小时(每15分钟振荡一次);
         
        5.  吸出各细胞培养孔中维持液;
         
        6.  接种长满单层的Vero-E6细胞(24孔板),每孔接种血清病毒混合液、标准血清对照及两种病毒对照 ,每稀释度两孔,100 ul/孔。37℃吸附1小时,每隔15分钟摇动一次;
         
        7.  加第一层琼脂糖覆盖液(需冷置42℃左右),每孔1 ml,室温下待凝固,细胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培养7-9天;
         
        8.  加第二层含中性红琼脂糖覆盖液,1 ml/孔,室温下待凝固,细胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培养2-5天,从第二天开始观察空斑数;
         
        9.  抗体滴度的判定,以比病毒对照的空斑数中和或减少50%的血清最高稀释度倒数判为待检血清中和抗体滴度;
         
        10.  型别判定:根据同一份血清与两种病毒的反应滴度不同来区分,如果一份血清与汉滩病毒 (或汉城病毒)反应的抗体滴度高于与汉城病毒(汉滩病毒)的抗体滴度4倍或以上,即判为汉滩病毒型,反之则为汉城病毒型。两者滴度相差无几时,则不好分型。不足4倍时亦不能定型。
         
        四、配方
         
        1.  第一层琼脂糖覆盖液
         
        交叉保护中和实验
         
        2.  第二层琼脂糖覆盖液 基本上同第一层琼脂糖覆盖液,仅将灭活胎牛血清改为5 ml,另加中性红溶液1 ml(333.0 ug/L中性红钠盐Gibco)。

        来源:丁香实验

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