第五代放射免疫分析方法及有关问题探讨

近年来，RIA技术研究取得重大进展，其主要的特征是将纳米磁性微粒子作为载体，经共价键结合制备成固相抗体，最大限度地简化了操作程序，缩短了反应时间，并为实现完全自动化检测创造了条件，使经典的RIA技术焕发了生机和活力，被列为第五代RIA 技术。

我们于2004年在国内首先开发这一技术的实验研究，先后研发出甲状腺系列、肿瘤标志物系列、性激素系列和糖尿病系列试剂盒，现将方法建立及有关问题作初步探讨。

一、标记物制备

（一）生物素化抗体按文献Eli方法制备，在双标记IRMA法采用标记纯化的McAbIgG，在竞争法采用标记纯化IgG。

（二）异硫氰酸荧光素（FITC）标记物采用微量透析法。标记的抗体依检测反应模式不同而异。

（三）标记物竞争法检测小分子化合物，标记物为抗原，双标记液相IRMA，标记物为McAb，标记方法按常规氯胺T氧化法。

二、磁性微粒子固相抗体制备

按照检测反应模式的不同，需要制备不同的磁性微粒子固相抗体]，如固相一抗体，固相二抗体。

取直径800～2000nm 磁性微粒子（表面羧基化），用生理盐水洗涤。按1O倍量悬浮于生理盐水中，在缓缓振荡下加入适量抗体IgG ，立即按IgG对偶联剂2O倍（M：M ）的量加入碳化二亚胺（EDC），在室温振荡下反应2h。再补加10倍量的EDC，移至4℃ 反应过夜。

次晨，再经生理盐水充分洗涤，直至上清液经紫外分光光度计280nm 测量A 值大于0.02。最后加含有0.5 BSA，0.1ONa N3的25mmol/L pH 7.4 PBS中，4℃保存。

三、IRMA检测法反应模式

（一）双标记FITC 抗FITC 法

将两株McAb分别标记FITC和I，按经优化的比例混合稀释液作为标记试剂。检测时，将样品和标记试剂各100ttL加至12×75mm管中，充分混合，放37℃水浴中30~60min，生成夹心免疫复合物。

加入抗FITC磁性微粒子悬浮液100tLL，室温反应5min，置磁性分离器上。倾去管中上清液，用PBS—T洗液0.5mL洗两次，在自动r计数器上按双对数或四参数方程处理测量数据，即可打印出相关参数和待测样品浓度。

（二）双标记BAS法

该法是将两株McAb分别标记生物素和I作为标记试剂，以磁性微粒子固相为分离试剂。其余同上法。

（三）磁性固相一抗法

此模式和常规IRMA的实验原理相同，将两株McAb分别标记I和制备磁性微粒子固相。检测时，取待测样品、I—McAb和磁性微粒子McAb悬浮液各100/1L于管中混匀，37℃温育后，即可在磁性分离器进行洗涤分离，去除游离I-McAb，操作虽简便，但主要缺点是每一检测项目要单独制备磁性微粒子固相抗体，既繁琐又不经济。

四、竞争法反应模式

（一）磁性固相一抗法

取一抗（PcAb）纯化，制成一抗磁性微粒子固相。检测时取待测样品和I标记抗原各50微升，磁性微粒子固相一抗悬浮液100微升加至12×75mm管中，充分混匀，置37℃温育3O～60min，在磁性分离器上倾去上清和洗涤2～3次。在自动r计数仪上测放射性强度，按Logit对log数据方程处理测量数据，即可得出有关参数和待测样品浓度。此模式因待测物的不同，要单独制备对应的磁性微粒子固相抗体。

（二）磁性固相二抗法

取样品、I标记抗原和抗体各50微升加至12×75mm管中，混合后置37℃ 温育30～60min，加入磁性固相二抗悬浮液100微升作为分离剂，混匀后室温反应5min，以下操作程序洗涤和测量同（一）法。

（三）抗FITC磁性固相二抗法

将第一抗体IgG标记FITC，用抗FITC磁性固相作为分离剂，最大优点是抗FITC二抗可以共用。检测时将待测样品、I标记抗原和FITC标记抗体各50微升加至管中，37℃温育3O～60min，加入抗FITC磁性固相悬浮液100微升，室温反应5min，以下洗涤和测量同（一）法。

（四）亲和素磁性固相法

此模式用BAS作为分离系统的共用试剂，第一抗体IgG 标记生物素。检测时，将待测样品、I标记抗原和生物素标记抗体各50微升加至管中，37℃ 温育后，加入BSA磁性微粒子悬浮液100微升，余法同（一）法。

五、第五代放免分析技术特征

（一）第五代方法

和第四代方法比，第五代方法是在第四代RIA技术的基础上，引入当代纳米磁性微粒子制成固相二抗分离剂，完全克服传统包被固相物理吸附方法制备固相抗体的不均一性，简化了操作程序，缩短了出报告的时间，主要技术参数比较如表1。

（二）磁性一抗和磁性二抗方法

比较根据反应原理可设计磁性固相二抗作为分离剂，或制备磁性固相一抗作反应试剂。两种方法比较见表2。

（三）三种分离剂比较

磁性固相分离剂可分为二抗、抗FITC二抗和BAS三种类型，其作用原理和性能不同见表3。

六、结束语

早在2O世纪8O年代有作者报道在RIA技术中采用磁性微球作为固相载体的方法学研究，提出了以共价键结合制备固相抗体的新颖性方法，而深受关注]。

因受当时技术条件所限，国内外许多作者的实验结果表明，制备的磁性微球粒径过大，均一性差，在免疫反应液中悬浮时甚短，达不到检测技术所要求的条件。

随着材料工艺制备技术的进步，至2O世纪9O年代中期纳米磁性微粒子研制取得成功，首先在化学发光免疫分析（CLIA）试剂中推广应用。

近年来，国外有磁性分离剂的RIA试剂盒进入国内市场，有关试剂制备技术和方法研究至今未见报道。作者根据国外磁性微粒子RIA试剂盒的实验原理，结合标记物制备的有关资料，开展了有关试剂制备技术和方法实验研究。

从现有的对比分析结果可以看出，本法目前应用最多的塑料管或塑料珠固相RIA相比较，主要具有以下优点：

（1）双标记IRMA设计新颖，两种标记抗体在液相中生成夹心免疫复合物，反应时间较短，连有抗FITC抗体的磁性微粒子作为固相分离剂，简便快速，可降低第一抗体的用量；

（2）经偶联剂将抗体IgG与磁性微粒子共价键结合，牢固性好，均一性高，连接蛋白质的量可以自行控制；

（3）连有抗FITC抗体的磁性微粒子作为固相分离剂可以通用，根据不同检测项目可以调整分离剂的用量，适合大量工业化生产；

（4）采用双标记IRMA检测生物活性肽类，不但简便快速，而且进一步提高了肽类检测的特异性和灵敏度。

Yallow和Berson创建RIA技术45年以来，在相同基本理论上派生出多种非放射性标记免疫分析，目前两类检测试剂盒在市场竞争中并存。由于RIA试剂有效期短，操作程序多，检出时间长，需要一定的辐射防护而处于弱势。

第五代RIA技术的研发成功和应用，最大限度地简化了操作程序，缩短了检测时间，并为实现完全自动化分析创造了条件。从而提高了竞争力。展望前景，第五代RIA技术在科研机构，高等院校和中小医院临床检测仍有相当大的发展空间。

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