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        酶免疫分析

        相关实验:抗体的纯化和鉴定实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        酶免疫分析

        酶免疫分析,如 E L IS A ,是免疫分析的主要部分。理解了 E L IS A 的实验原理,就可以 理 解 其 他 以 抗 原 -抗 体 反 应 为 基 础 的 实 验 原 理 。依 据 其 实 验 操 作 程 序 ,我们知道E U S A 方法能检测任何给定抗体的特异性、亲和 性 、浓度及灵敏性。下面是进行直接或间 接 E L IS A 的操作步骤。直接与间接 E L IS A 的操作步骤基本是相同的。不同之处是与目标配体相结合的一抗是否是酶标抗体。在直接分析中,一抗是酶标抗体;在间接分析中 ,一抗不是酶标抗体,酶标记在识别一抗的二抗上。

        一、试剂和材料

        稀 释 液 : 150mmol/L P B S , p H 7. 6

        包被缓冲液: 200mmol/L 碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液,pH 9. 5

        洗漆缓冲液: 150mmol/L PBS 加 0. 0 5 % T w e e n

        封闭缓冲液: 150mmol/L P B S 加 1 % 脱脂奶粉

        一抗,交联或不交联酶,如 H R P 、碱性磷酸酶或者生物素

        二抗,与一种酶,如 H R P 、碱性磷酸酶交联或者与生物素相交联

        T M B (酶底物)

        终 止 液 : 0. 6mol/L HCl

        二、操作步骤

        (1) 在进行分析前,应首先建立酶标板每孔的加样策略。永远要设立空白孔作为阴性对照。例如,如果打算对血清或者培养上清进行抗体浓度滴定,我们常常是仅在奇数孔包被抗原,而如果是进行杂交瘤的阳性筛选,除了一个或者两个孔留作空白对照外,我们将整块板包被抗原。

        (2) 进行分析前最好过夜包被酶标板。这 样 ,目标配体便有足够的时间与孔结合。孔板的包被可以放置在4,最长时间可达 2 周 。用包被缓冲液稀释配体至2〜5|ixg/m l。每个孔用 0. 1ml 的稀释配体进行包被。

        (3) 进行分析时,从冰箱里拿出包被板。倒掉孔中的液体,用洗涤缓冲液洗整块孔板3 次 。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

        (4) 向所有孔中加 300ju l的封闭缓冲液。将孔板于室温静置至少30 m in ,然后用洗漆缓冲液洗孔板一次。

        (5) 在封闭孔板的同时,用 PBS 稀释一抗。如果是筛选抗血清,我们通常进行 5 倍的倍比稀释,起 始 点 为 1 : 50 或 1 : 100。如要检测培养上清,进 行 2 倍的倍比稀释可能是适当的。如果是检测杂交瘤培养上清,不要做任何的稀释。

        (6) 如果一抗是酶标抗体,可将其进行 1 : 1 00〜1 : 10 000稀释。可对几个稀释度的抗体进行测定。

        (7) 向孔中加人 100W 稀释的抗体。对于系列稀释的抗体,最好每个稀释度加双份孔(一 共 4 个孔)。 37℃孵育孔板 30m in。

        (8) 孵育后,用洗涤缓冲液洗板 3 次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

        (9) 如果向孔板加入的是酶标一抗,越过此步而直接进行步骤 10。 间接分析中,向所有的孔中加人 100/zl稀释的酶标二抗。 30℃ 孵育孔板 30 min。

        (10) 用洗涤缓冲液洗孔板 5 次 。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

        (11) 向所有的孔中加入100/x l的 T M B 底物。观察颜色的变化。让颜色反应到阴性对照显示轻微的颜色。这种现象未必会发生。如果不发生,5〜10 m in 后终止反应。

        (12) 用 50//1 的终止液终止反应。

        (13) 在酶标仪上以适当的吸光波长读取孔板颜色强度的数值。 T M B 底物自身的背景读数为 450nmol/L 。数值越大,抗体越多。

        图 7. 9 显示的是一个滴定结果读数的直方图 。 一 个纯化的单克隆抗体被稀释后加人
        到 用 其 特 异 性 配 体 包 被 的 板 中 。图 7. 9 中 可 以 看 出 ,即 使 在 单 克 隆 抗 体 被 稀 释 到6.25ng/ml 时 ,其特异的活性仍能被检测到。滴定结果。

        来源:丁香实验

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