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        杂交瘤的克隆化 :软琼脂培养法

        互联网

        4003

        杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。

        要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。

        即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。

        克隆化的方法很多,最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。

        软琼脂培养法克隆具体步骤如下:

        (1)软琼脂的配制:含有20%NCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640。

        ①1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。

        ②0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

        (2)用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。

        (3)按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

        (4)1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

        (5)混匀后立倾注于琼脂基底层上,在室温中10min,使其凝固,孵育于37℃、5%CO2孵箱中。

        (6)4~5天 后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔中进行培养。

        (7)检测抗体,扩大培养,必要是地再克隆化。

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