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        软琼脂集落形成实验

        相关实验:细胞集落形成实验

        最新修订时间:

        简介

        软琼脂集落形成实验可用于非锚着依赖性生长的细胞进行集落生成。

        原理

        软琼脂集落形成实验的原基本理是利用软琼脂作为培养基质,在单个细胞在体外持续增殖 6 代以上,其后代形成一个细胞群体,称为集落。


        每个克隆均包含 50 个细胞以上,大小在 0.3~1.0 mm 之间。通过计算集落形成率,来测定测试细胞的增殖能力。

        材料与仪器

        器材:

        ① HeLa 细胞

        ② 细胞计数板

        ③ 60 mm 培养皿

        ④ 10 mL 移液管

        ⑤ 小烧杯

        ⑥ 10 mL 吸管橡皮头

        ⑦ 超净工作台

        ⑧ 37 ℃ CO2 孵箱

        ⑨ 倒置相差显微镜离心机

        ⑩ 水浴锅。

        试剂:

        ① RPMI-1640 培养液

        ② 胎牛血清

        ③ 0.25% 胰蛋白酶

        ④ 吉姆萨染液

        ⑤ 琼脂

        步骤

        软琼脂集落形成实验基本过程可分为以下几步:

        A. 消毒

        B. 培养液与消化液在 37 ℃ 恒温箱内预热。

        C. 细胞悬液制备,取对数生长期细胞,用 0.25% 胰蛋白酶消化,吹打形成单细胞悬液。1000 r/min 离心 8 min,弃上清液,用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液将细胞重新悬浮。在计数板上计数细胞,并用培养基调整细胞浓度,以备使用。

        D. 制备半固体琼脂,分为底层和上层。

        底层琼脂:称取琼脂 0.25 g,加入双蒸水 32 mL,高压灭菌后冷却至 50 ℃,依次加入 50 ℃ 预热的 5 倍浓缩的 RPMI-1640 培养基 8 mL、小牛血清 10 mL、青霉素 100 U/mL、链霉素 100 μg/mL、8% NaHCO3 0.2 mL,混匀后分装于 60 mm 培养皿中,每皿加入 3 mL,水平放置,室温冷却凝固。

        上层琼脂:称取琼脂 0.15 g,加入双蒸水 32 mL,高压灭菌后冷却至 40 ℃,依次加入成分同上,混匀后置于 40 ℃ 水浴中保温,防止凝固。

        E. 将细胞浓度调整到 105 个/mL。

        F. 取 0.1 mL 细胞悬液,加入到 5 mL 40 ℃ 的上层琼脂液中,混匀后迅速取 0.5 mL 加入到铺有底层琼脂的培养皿中,在室温下水平放置 10 min,待上层琼脂凝固后移入 CO2 孵箱,在 37 ℃ 下培养 2~3 周。上层琼脂中细胞最终浓度为 2000 个/mL。

        注意事项

        1. 细胞悬液中单个分散细胞应多于 90%。

        2. 软琼脂培养时,注意在琼脂与细胞混合时温度不要超过 40 ℃,以免烫伤细胞。

        3. 接种细胞密度不宜过高。

        来源:丁香实验

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