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        淋巴细胞转化

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        实验步骤

        采血:

        需要在严格无菌条件下采血。肝素抗凝,室温保存,24hr-72hr转化效率高。也有保存更长时间,采血后不要将血液置冰箱中,长途运输也不要冷藏。

        分离淋巴细胞:

        采集血液4-5mL,与2mL1640(含1%双抗)在离心管内混合,然后缓慢沿管壁注入淋巴分离液(已37℃预热),3000rpm离心30min。

        收集白细胞层,转移至另一离心管中,加入10mL1640(含1%双抗),轻轻吹打均匀,1500 rpm离心15min。弃上清,如此反复洗涤3次,收集白细胞。

        转化

        取1 mL全培养基(+0.5%pHA)加入已经洗涤三次的白细胞离心管中,轻轻吹打均匀,转入24孔板中,加入自备EBV液0.6mL,20ug/ mL环孢霉素0.2 mL,放入37℃5%CO2培养箱中培养。

        3-4天后观察细胞,镜下可见集合的细胞团,以及已被转化的明显增大的类淋母细胞,4-5天后可加入0.5 mL全培养基(1640+15%FBS+1%双抗+1.6%1M Hepes),然后视细胞生长情况更换培养基,并且转入培养瓶中。

        附:

        EBV液制备:

        培养B95-8细胞,待细胞长满,培养基变黄,收集于50mL离心管中,于-80℃冰箱中,过夜,37℃水浴融化,再置于-80℃冰箱中,如此反复冻融三次,2000 rpm离心20min,上清0.2um过膜,-80℃冰箱中冻存备用。

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