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        Southern杂交鉴定方法

        互联网

        4481

        1. 取10ul待测DNA,于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。(20mL,1.0%凝胶)

        2. 凝胶用溴化乙锭染色,切掉凝胶四周多余部分,并在凝胶的一角作一记号,拍照记录电泳结果(拍照时,凝胶旁放一尺子)。

        3. 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)

        ① 将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min,使DNA脱嘌呤。

        ② 用蒸馏水短暂洗凝胶2次。

        ③ 将凝胶浸没入30mL变性液中30min,使凝胶变性。

        ④ 将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。

        重复④一次。在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(4、5)。

        4. 准备DNA从凝胶向膜转移的平台

        5. 将1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小,并在尼龙膜一角做一标记。另1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度,长度(约18cm)足以达到转移液盒子的底部。准备10 X SSC 转移液。

        将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后,再浸入10 X SSC 转移液中。

        6. 安装毛细管转移装置

        ① 将长的滤纸放在转移平台的顶部,滤纸两端达到转移盒的底部,做成虹吸桥。

        ② 将80mL转移液倒入转移盒内,并湿润滤纸。

        ③ 将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上,凝胶与滤纸间避免有气泡。

        ④ 用保鲜纸封住凝胶四边。

        ⑤ 将浸湿的转移膜置于凝胶的上部,凝胶与膜间避免有气泡。

        ⑥ 将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面,并放一叠吸水纸搭在滤纸上,再放一玻璃板,其上压一重物。

        ⑦ 转移几小时或过夜(至少4小时)

        注意:勿使转移液干枯。

        7. 已转移的DNA与膜交联

        ① 将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上,有DNA的一面朝上。

        ② 将膜置于UV crosslinker中,在紫外光下自动交联。

        ③ 用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜,空气中干燥。

        此膜可在4℃长期保存。

        8. DNA探针的制备(略过)

        参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。

        9. 印迹的预杂交

        将适量的预杂交液DIG Easy Hyb在42℃预热。放入印迹膜,在42℃预杂交30min。

        10. 准备探针

        水煮地高辛标记的探针5min使变性,并立即放在冰上2min.

        11. 加适量的探针到已预热的杂交液中,混合均匀(避免形成泡沫,影响杂交效果)。42℃杂交至少4小时或过夜。

        注意:不要将探针直接加在印迹膜上,而应加在容器一角的预杂交液中

        12. 印迹膜的冲洗:

        ① 将杂交液倒出,储存起来可再次使用。

        ② 用25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次,每次5min。

        ③ 用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65℃摇动洗膜2次,每次15min (用杂交炉)。

        13. 免疫检测:

        ① 用10mL冲洗液洗膜1-5min。

        ② 膜在15mL阻断液中孵育30min

        ③ 膜和8mL抗体孵育30min

        ④ 在15mL冲洗液中洗膜2次,每次15min。

        ⑤ 在15mL检测液中平衡2-5min。

        14. 将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上,滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜; 然后,立即用保鲜纸包裹, 挤掉多余的CSPD ready-to-use,使其均匀平铺在膜上,没有气泡,但避免使膜干掉。室温孵育5min。

        15. 在37℃孵育潮湿的膜10min,增强发光。

        16. 用X-光底片将杂交膜进行曝光10-25min。(发光性能至少可持续48小时)

        17. X-光底片的冲洗。

        Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片。

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