• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        affymetrix芯片实验步骤-中文版

        互联网

        6776

        目 录

        第一章 总 RNA 的纯化( RNeasy ® Kit ) .................. ..... ...... 3

        第二章 由 RNA 合成双链 DNA .............................................. 4

        一、反转录合成第一链 cDNA ............................................ 4

        二、反转录合成第二链 cDNA ............................................ 5

        第三章 生物素标记 cRNA 合成 ............................................. 6

        三、体外转录合成标记 cRNA ............................................ 6

        四、 aRNA 纯化 .................................................................. 6

        第四章 杂交、洗涤、染色、扫描芯片 ......................... .. ....... 8

        五、片断化 ........................................................................... 8

        六、杂交 ............................................................................... 8

        七、洗涤、染色和扫描 ....................................................... 9

        第一章 总 RNA 的纯化( RNeasy ® Kit )

        通常在使用TRIzol 法抽提组织总 RNA 时,因为方法的限制,造成总 RNA 的纯度降低,影响探针的标记和芯片杂交。所以需使用 QIAGEN RNeasy Kit 进一步的纯化。详细操作原理和方法见 Rneasy Mini Protocol for RNA Cleanup 。

        1. 根据需纯化的样品数配制DNase I 混合液,每个样品需要 80 μL的 DNase I 混合液,按 10 μL DNase I的储存液加入 70 μL Buffer RDD配制。

        2. 取经质检合格的总RNA≤100 μg溶解于 100 μL RNase-free的水中,再加入 350μL Buffer RLT 并充分混匀

        3. 加入250 μL无水乙醇, Tip 头充分混匀。

        4. 将共计700 μL含总 RNA 的溶液转入套在 2 m L 离心管内的RNeasy mini 柱子内, 8,000 g离心 15 ~ 30 s, 弃去滤过液。

        5. 加350 μL Buffer RW1到离心柱内。盖上管盖, 8,000 g离心 15 s,弃去滤过液。

        6. 直接加入DNase I 混合液( 80 μL)到离心柱膜上,室温放置 15 min 。

        7. 加350 μL Buffer RW1到离心柱内。盖上管盖, 8,000 g离心 15 s,弃去滤过液。

        8. 吸取500 μL Buffer PRE到 RNeasy mini 柱子内, 8,000 g离心洗涤 15 s ,弃去滤过液,再用500 μL Buffer PRE在 8,000 g离心洗涤 2 min ,弃去滤过液和2 m L 套管,将RNeasy mini 柱子转入一新的 1.5 m L Eppendorf管中。

        9. 吸取40 μL RNase free的水, ≥8000 g离心洗脱 1 min 。

        10. 重复步骤9 一次。

        11. 测定OD 值(通常 OD 数值在 1.8 ~ 2.1之间)

        第二章由 RNA 合成双链 DNA

        一、反转录合成第一链 cDNA

        1 、准备 Poly-A Control

        按下表稀释 Poly-A Control :

        表 1.1

        起始总 RNA 量

        连续稀释

        加到样品中体积

        1

        2

        3

        4

        50 ng

        1 : 20

        1 : 50

        1 : 50

        1:20

        2 μL

        100 ng

        1 : 20

        1 : 50

        1 : 50

        1:10

        2 μL

        250 ng

        1 : 20

        1 : 50

        1 : 50

        1:4

        2 μL

        500 ng

        1 : 20

        1 : 50

        1 : 50

        1:2

        2 μL

        2 、准备总 RNA/Poly-A RNA Control 混合液

        在冰上按照下表准备总 RNA/Poly-A RNA Control 混合液。

        表 1.2

        Component

        Volume

        Total RNA Sample (50-500 ng)

        variable

        Diluted Poly-A RNA Controls (Fourth Dilution)

        2 μL

        Nuclease-free Water

        variable

        Total Volume

        5 μL

        3 、准备第一链反应混合液

        A 、在冰上溶解一链反应试剂

        B 、在冰上按照下表准备第一链反应混合液。

        表 1.3

        Component

        Amount

        First-Strand Buffer Mix

        4 μL

        First-Strand Enzyme Mix

        1 μL

        Total volume

        5 μL

        C 、转移 5 μL 准备好的第一链反应混合液到反应管。

        4 、加 RNA/Poly-A RNA Control 混合液

        A 、转移 5 μL 准备好的 RNA/Poly-A RNA Control 混合液到已经分装好第一链反应混合液的反应管中,至总体积 10 μL 。

        B 、轻轻振荡混匀,低速离心收集反应液到管底。

        5 、运行反应

        A 、在 PCR 仪上运行 42 o C 2 h 。

        B 、反应后低速离心收集反应液到管底,放置冰上并立即进行第二链 cDNA 合成反应。

        二、反转录合成第二链 cDNA

        1 、准备第二链反应混合液

        A 、在冰上按照下表准备第二链反应混合液:

        表 2.1

        Component

        Amount

        Nuclease-free Water

        13 μL

        Second -Strand Buffer Mix

        4 μL

        Second -Strand Enzyme Mix

        1 μL

        Total volume

        5 μL

        B 、轻轻振荡混匀,低速离心收集反应液到管底。

        C 、转移 20 μL 第二链反应混合液至( 10 μL ) cDNA 样品管中,混匀,低速

        离心收集反应液到管底。

        2 、运行反应

        A 、在 PCR 仪上运行 16 o C 1 h, 65 o C 10 min 。

        B 、反应后低速离心收集反应液到管底,放置冰上并立即进行 IVT 。

        第三章 生物素标记 cRNA 合成

        三、体外转录合成标记 cRNA

        1 、准备 IVT 混合液

        A 、在室温按照下表准备 IVT 混合液。

        表 3.1

        Component

        Amount

        IVT Biotin Label

        4 μL

        IVT Labeling Buffer

        20 μL

        IVT Enzyme Mix

        6 μL

        Total volume

        30 μL

        B 、轻轻振荡混匀,低速离心收集反应液到管底。

        C 、转移 30 μL IVT 混合液至( 30 μL )双链 cDNA 样品管中,混匀,低速离

        心收集反应液到管底。

        2 、运行反应

        A 、在 PCR 仪上运行 40 o C ,时间长度依赖于起始 RNA 投入量,见下表。

        表 3.2

        RNA Amount

        IVT Incubation Time

        50 – 250 ng

        16 hours

        100 – 500 ng

        4 hours

        3 、立即纯化或 -20 o C 保存。

        四、 aRNA 纯化

        提前在 50 ~ 60 o C 预热 aRNA Elution Solution 10 min以上。

        1 、准备 aRNA Binding 混合液。

        在室温按照下表准备 aRNA Binding 混合液。

        表 4.1

        Component

        Amount

        RNA Binding Beadundefined

        10 μL

        aRNA Binding Buffer Concentrate

        50 μL

        2 、加 aRNA Binding 混合液

        A 、加 60 μL aRNA Binding 混合液到每个样品。

        B 、转移样品到 U 型板。

        C 、用枪上下混匀几次。

        3 、 aRNA Binding

        A 、加 120 μL 100% 乙醇到每个样品。

        B 、用枪上下混匀几次。

        C 、轻轻振荡混匀,≥ 2 min 。

        4 、 RNA Binding 磁珠收集

        A 、转移 U 型板到磁力架上放置约 5 min 。

        B 、小心吸取上清,丢弃,取下 U 型板。

        5 、洗涤磁珠

        A 、加 100 μL aRNA Wash Solution 到每个样品,振荡 1 min 。

        B 、转移 U 型板到磁力架上放置约 5 min 。

        C 、小心吸取上清,丢弃,取下 U 型板。

        D 、重复 A-C 一次。

        E 、剧烈振荡 U 型板 1 min 。

        6 、 aRNA 洗脱

        A 、加 50 μL 预热的( 50 ~ 60 o C ) aRNA Elution Solution 到每个样品中,从磁珠上洗脱下纯化后的 aRNA 。

        B 、 剧烈振荡 U 型板 3 min 。检查磁珠是否全部混匀,如果没有,继续振荡至磁珠全部混匀。

        C 、转移 U 型板到磁力架上放置约 5 min 。

        D 、转移上清到一个新的 N uclease-free 管中。

        7 、保存 aRNA 在 -20 o C 以下的温度或者放在冰上进行定量和片断化。

        第四章 杂交、洗涤、染色、扫描芯片

        五、片断化

        1 、准备 aRNA 片断化混合液。

        表 5.1

        Component

        49/64 Format

        100 Format

        169/400 Format

        aRNA

        15 μg (1 to 32 μL)

        12 μg (1 to 24 μL)

        7.5 μg (1 to 16 μL)

        5x Array Fragmentation Buffer

        8 μL

        6 μL

        4 μL

        Nuclease-free Water

        Variable (up to 40 μL final volume)

        Variable (up to 30 μL final volume)

        Variable (up to 20 μL final volume)

        2 、片断化反应。

        A 、 94 o C 反应 35 min。

        B 、反应结束后立即放置冰上。

        3 、电泳检测片断化产物片段大小,约为 35 ~ 200 nt 。

        4 、立即进行杂交实验或冻存。

        六、杂交

        1 、按照下表根据杂交芯片种类准备杂交液。

        表 6.1

        Component

        49 (Standard) / 64 Format

        100 (Midi)

        169 (Mini) / 400 (Micro)

        Final Dilution

        Fragmented and Labeled aRNA

        12.5 μg (33.3 μL)

        10 μg (26.7 μL)

        5 μg (13.3 μ L)

        0.05 μg/ μL

        Control Oligonucleotide B2 (3 nM)

        4.2 μL

        3.3 μL

        1.7 μL

        50 pM

        20X Hybridization Controls (bioB, bioC, bioD, cre)

        12.5 μL

        10 μL

        5 μL

        1.5, 5, 25, And 100 pM respectively

        2X Hybridization Mix

        125 μL

        100 μL

        50 μL

        1X

        DMSO

        25 μL

        20 μL

        10 μL

        10%

        Nuclease-free Water

        50 μL

        40 μL

        20 μL

        Total Volume

        250 μL

        200 μL

        100 μL

        2 、在室温平衡芯片。

        3 、 99 o C 加热杂交液 5 min。

        4 、同时加适量(见表 6.2 )预杂交液到芯片。

        表 6.2

        Array

        Volume

        49 Format (Standard)

        200 μL

        64 Format

        200 μL

        100 Format (Midi)

        130 μL

        169 Format (Mini)

        80 μL

        400 Format (Micro)

        80 μL

        5 、芯片预热 10 min 。

        6 、杂交液 99 o C 加热后, 45 o C 放置 5 min。

        7 、最大速度离心杂交液 5 min 。

        8 、加杂交液到芯片里, 45 o C , 60 rpm 杂交 16 h 。

        七、洗涤、染色和扫描

        1 、准备好洗涤工作站和扫描仪。

        2 、分别分装 600 μL stain1 , 600 μL stain2 , 800 μL Array Holding Buffer ,放置到洗涤工作站的相应位置。

        3 、选择相应的洗涤程序,按下软件开始洗涤染色按钮进行洗涤染色芯片。

        4 、芯片洗涤染色后放进扫描仪,按下软件开始扫描按钮进行扫描芯片。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序