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        正交法测定几种因素对酶活力的影响

        互联网

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        一、实验目的

        1.初步掌握正交法(正交试验设计法)的使用。

        2.运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH 值这四种因素对酶活力的影响。

        二、实验原理

        酶的催化作用是在一定条件下进行的,它受多种因素的影响,如酶浓度、底物浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下,通过某一因素在一系列变化条件下的酶活力测定求得该因素的影响,这是单因素的试验方法。

        对于多因素的试验可以通过正交试验设计法(简称正交法)来完成。正交法是借助于正交表,简化表格计算,正确分析结果.找到实验的最佳条件、分清因素的主次,这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。

        本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH 值这四个因素对酶活性的影响,并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH 值时酶的活力最大。

        三、 仪器 、原料和试剂

        仪器

        试管及试管架、恒温水浴箱、小漏斗及滤纸、分光光度计、吸量管、小漏斗及滤纸、 pH 计。

        原料

        牛血清白蛋白、牛胰蛋白药。

        试剂

        1. 牛血清白蛋白:20mL 蒸馏水中加入牛血清白蛋白2.2g,尿素36g,1mol/LNaOH 溶液8mL,室温放置1h,使蛋白质变性。如有不溶物,可过滤除去。再加0.2 mol/LNaH 2 PO 4 溶液至110mL 及尿素4g,调节溶液pH 达7.6左右。

        2. 蛋白酶液:3mg 牛胰蛋白酶冷冻干粉,溶于10mL 蒸馏水。

        3. 15%三氯乙酸溶液:15g 三氯乙酸溶于蒸馏水.并稀释至100mL。

        4. lmol/LpH 7、8、9巴比妥缓冲液

        5. Fo1in-酚甲 试剂

        ① 4%碳酸钠溶液; ②0.2%氢氧化钠溶液;
        ③1%硫酸铜溶液; ④2%酒石酸钾钠溶液

        临用前将①与②等体积配制碳酸钠氢氧化钠溶液。②与④等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后把这两种试剂按50:1的比例混匀。即成Folin—酚甲试剂。此试剂临用而配制,一天内有效。

        6. Folin—酚乙试剂

        向2L 容积的磨口回流瓶中加入100g 钨酸纳(NaWO 4 ·2H 2 O),25g 钼酸钠(NaMoO 4 H 2 O)及700mL蒸馏水,再加人85%磷酸50mL 及浓盐酸100mL,充分混和后,接上回流冷凝管,以小火回流10h(烧瓶内加小玻璃珠数颗,以防止溶液沸溢)。

        回流结束后再加入150g 硫酸锂(Li 2 SO 4 ),50mL 蒸馏水及液溴数滴,然后开口继续沸腾15min,以驱除过量的溴,冷却后溶液呈鲜黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加溴水的步骤),冷却后加蒸馏水定容至1000mL,过滤,即成Folin—酚乙试剂,滤掖置于棕色试剂瓶中,可在冰箱内长期保存。

        若此储存液使用过久,颜色由黄变绿,可加几滴液溴,煮沸数分钟,恢复原色仍能继续使用。

        Folin—酚乙试剂储存液在使用前使酸度最终为1moL/L。可用标准NaOH 溶液(1mol/L 左右),以酚酞作指示剂,当溶液颜色由红一紫色一紫-灰墨绿时即为滴定终点。该试剂储存液的酸度应为2moL/L 右,将之稀释至相当于1moL/L,酸度便可使用。

        7. 0.1mol/LNaH 2 PO 4 溶液

        8. 尿素

        9. 1mol/LNaOH 溶液

        四、操作步骤

        (一)实验设计

        1.确定试验因素和水平

        本实验取四个因素,即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH 值。每个因素选三个水平(水平即在因素的允许变化范围内,要进行试验的”点”)。试验因素和选用水平如下表所示。

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