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        大肠杆菌杂交及基因定位实验

        互联网

        5312

        一、原理

        大肠杆菌染色体呈环状。高频重组菌株(Hfr)的染色体上整合有F因子,当Hfr细菌与F-细菌细胞发生接合(即杂交)时Hfr细胞(供体菌)的染色体从Hfr细胞向F-细胞内转移。

        由于染色体的转移具有一定的方向性,并且可以随时中断,因此根据结合后F-细菌(以重组子形式选出)中Hfr细菌染色体基因出现次数的多少,即可得知基因转移的先后顺序,也就是说基因在染色体上排列的顺序。

        转移时,靠近转移起始点的染色体基因进入F-细胞的机率大,重组频率高,远离转移起始点的基因进入F-细胞的机会少,重组率低,F因子大部分位于转移起始点相对的一端(末端)。因此转移的频率很低。只有当接合时间很长,足以使整个染色体转入F-细胞(受体)时,才会使F-细胞转变为Hfr或F+状态。

        基因定位时首先要从Hfr与F-细菌的混合培养物中筛选出某一Hfr与F-细菌基因(选择性标记基因)已经发生了重组的细菌(重组子),然后在这些重组子中逐个测定其它的Hfr基因(非选择标记)出现的次数。

        Hfr菌株染色体上的选择性标记应位于染色体前端,这样才能保证以100%的频率出现在重组子中。选择性标记之后的基因,则以低于100%的频率出现在重组子中。F-细胞的选择性标记应起到排除Hfr菌生长的作用(即反选择)。

        本实验使用的F-菌株为Strr, Hfr菌为Strs,借此可排除Hfr菌的生长。另一方面为保证Hfr基因有机会出现在重组子中,反选择性标记应位于染色体后端。为了使Hfr菌株有较高的接合频率,F-细菌应该过量以保证每一个Hfr细菌都能与F-细菌接合(10~20:1)。

        二、目的

        通过本实验,了解大肠杆菌杂交及其基因在染色体上的排列方式,并掌握大肠杆菌接合及染色体基因定位的原理与方法。

        三、材料、试剂与器具

        1、受体菌:FD1004 F-leu purE trp his metA ilv arg thi ara lacY xyl mtl galT strr rifr。

        2、供体菌:CSH60 Hfr sup strs。

        3、生理盐水:0.85%NaCl。

        4、10×A缓中液。

        5、基本培养基。

        6、LB培养基。

        7、选择培养基[B]—[G]:基本培养基加氨基酸。

        8、培养皿、三角瓶、吸管、灭菌牙签、摇床、酒精灯、接种环。

        四、操作步骤

        1、第一天傍晚,分别接一环供体菌和受体菌于5ml LB培养液中,37℃振荡培养10-12小时。

        2、第二天清晨,各取1ml过夜培养物,分别加入到2个盛有5ml LB培养液的250ml三角瓶,37℃振荡培养2-3小时。

        3、吸取0.5ml供体菌和4.5ml受体菌,加入到一个无菌的250ml三角瓶中混合,置37℃摇床上培养100分钟。

        4、将上述接合菌液用生理盐水稀释100、10-1、10-2倍。

        5、各吸取0.1ml稀释液涂布在选择培养基[A]平板上,每一种稀释液涂布2个平板。同时将供体菌及受体菌分别吸取0.1ml涂布在[A]上作对照,每种各2个平板。此后均于37℃条件下培养48小时。

        6、第四天,1)观察和计数选择培养基[A]平板上接合组和对照组的菌落生长状况;2)在与平皿相同大小的白纸上画100个小格,将圆片贴于选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的底部,然后用灭菌牙签从接合组选择培养基[A]平板上随机挑选100个菌落,对号点种在选择培养基[B]、[C]、[D]、[E]、[F]和[G]平板的100个小格中;3)将所有平板置于37℃箱内培养48小时。

        7、第六天,统计在各种选择平板上生长菌落的数目,记录。并绘制出基因顺序图。

        选择性培养基附加成份表

        培养基编号

        选择性标记

        基本碳源

        基本培养基(A)中补充物质

        str

        rif

        arg

        ilv

        met

        leu

        ade

        trp

        his

        A

        Met leu str

        葡萄糖

        B

        (met leu str)arg

        葡萄糖

        C

        (met leu str)trp

        葡萄糖

        D

        (met leu str)his

        葡萄糖

        E

        (met leu str)lac

        乳糖

        F

        (met leu str)gal

        半乳糖

        G

        (met leu str)rif

        葡萄糖

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