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        消减杂交实验

        相关实验:消减杂交实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        稀释缓冲液(20 mmol/L HEPES>HCl、pH8.3,50 mmol/LNaCl,0.2 mmol/L EDTA)

        4X 杂交缓冲储存液:4mol/L NaCl,200 mmol/L HEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷

        基三乙基溴化铵(CTAB)。最终的 1X 杂交缓冲液,用稀释缓冲液稀释。

        矿物油

        2. 核酸和寡核苷酸

        连接 Ad1 的检测者 1-1(方案 1 第 4 阶段第 8 步)

        连接 Ad2R 的检测者 1-2(方案 1 第 4 阶段第 8 步)

        驱动 DNA(方案 1 第 3 阶段第 5 步)

        Rsa I 消化的驱动 DNA(方案 1 第 3 阶段第 5 步)

        3. 专用设备

        两台热循环仪(见第 11 步和第 12 步)

        二、方法

        1. 第一次杂交

        (1)按照下面的顺序,将每个检测者样品与试剂混合。

        (2)用 1 滴矿物油覆盖样品,并短暂离心。

        (3)将样品在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。

        (4)根据样品类型,按照下面列出的时间将样品在 68°C 温育,然后立即进入第二次杂交。

        消减杂交实验

        本方案使用 15ng 连接的检测 DNA 和 450ng 驱动 DNAa 如果得要不同的消减效率,可以改变驱动者和

        检测者的比例。

        2. 第二次杂交

        (9)(原文无 5~8 步—译者注)对每个实验的驱动 DNA, 重复下面步骤。

        消减杂交实验

        将下面的试剂,加至灭菌的 0.5 ml(原文为 1ul。一译者改)离心管中。

        (10)从混合物中取 1ul, 加至 0.5 ml 离心管中,并加 1 滴矿物油覆盖。

        (11)在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。

        (12)将刚刚变性的驱动者离心管取出,立即放入另一台已稳定在 68°C 的热循环仪中。
        使用另一台热循环仪(或另一个 block) 可以确保样品的迅速降温。

        (13)然后,按照同样的顺序,依次加入已杂交的样品 1-1 和 1-2(来自第一次杂交)。
        这样确保在刚变性的驱动 DNA 过董的情况下,两个杂交样品漫合。

        (14)将杂交反应液在 68°C 温育过夜。

        (15)加入 100ul 稀释缓冲液,并吹吸混匀。

        (16)在热循环仪中 72°C 温育 7 min。

        (17)在-20°C 保存杂交反应液。

        来源:丁香实验

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