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        PCR产物纯化之试剂盒回收法

        丁香园论坛

        10023

        今儿我们来聊聊 PCR 产物纯化。PCR 产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP,这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程,因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多,商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。

        PCR 产物纯化回收试剂盒(SunShinecleanTM PCR Product Recovery kit)可简单、快速、有效的从PCR反应或其它各种酶促反应液中纯化 DNA 片段。根据回收片段大小不同,最高回收率可达到95%,有效的去除酶蛋白、DNA引物和dNTP等。

        获得的DNA可用于克隆,标记,限制性酶切,体外转录/翻译等实验。

        操作流程如下:

        1. 取SunShinecleanTM DNA Mini Column 柱裝于2 ml 收集管上(已备)。加入500 μl Buffer B 平衡液至柱子內,室温下10,000 rpm 离心1 min,使平衡液完全流过柱子。弃去收集管中的平衡液,重新将DNA Mini Column柱装于该收集管上。

        2. 将需要纯化的DNA(少于100 ul)置于干净的1.5 ml的EP管内,加入300-500 ul Buffer K,充分混匀。

        (注:一些PCR产物可能含有石蜡油,石蜡油可能会导致回收率降低。因此我们建议将石蜡油尽量清除。)

        3. 将混合液转移到第一步已经平衡的柱子里面,室温放置2 min,10,000 rpm离心1 min。

        4. 弃去收集管中的滤液,将柱子装回2 ml收集管内,加入700 μl Buffer W(已用70%乙醇溶解的)至柱子中。室温下10,000 rpm离心1 min。

        (注:浓缩的Buffer W在使用之前请用70%乙醇溶解。)

        5. 重复步骤4一次。

        6. 弃去收集管中的滤液,将柱子装回2 ml收集管内。室温下,12,000 rpm离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。

        (注:省去这一步将导致残留乙醇于DNA中。)

        7. 把柱子装在一个干净的1.5 ml离心管上,加入10-50 μl(具体取决于预期的终产物浓度)Buffer E(可用超纯水或TE缓冲液代替)到柱基质的膜中央,室温放置0.5-1 min,12,000 rpm离心1 min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出80%以上的结合DNA。如果再洗脱一次的话,可以把残余的DNA洗脱出来。

        注意事项:

        1. 若用水洗脱DNA,水的pH值应在8.0-8.5范围内,pH 值低于8.0会降低洗脱效率。

        2. DNA需长期保存时,建议在Buffer E中保存。

        3. 洗脱液提前在水浴锅中50-60 ?C预热,可提高DNA回收率。

        4. 浓缩的Buffer W在使用之前请用70%乙醇溶解。

        5. 建议使用新配的TAE Buffer作为电泳缓冲液。TBE Buffer或反复使用的TAE Buffer作为电泳缓冲液,都将影响DNA回收率。

        想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你,都可以成为师兄的好伙伴

        师兄微信号:shixiongcoming

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