制备克隆用PCR产物的纯化
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原理
PCR 产物经酚:氯仿抽提、乙醇沉淀及其他一些常用方法纯化后，DNA 样品内还往往残留了一些具有酶活性的 Taq DNA 酶与另外一些热稳定 DNA 聚合酶（Cioweetal. 1991; Bamesl992)。这些残余的 DNA 聚合酶连同一些残余的 dNTP 的持续存在，常常妨碍有待进一步克隆的扩增 DNA 片段末端的剪切。例如，残余的 DNA 聚合酶常常填平由限制性内切酶消解产生的 3' 凹末端。毫无疑问，Tag DNA 聚合酶的持续存在可用来解释许多实验室为克隆 PCR 产物时常遇到的难题，即 PCR 扩增片段经由相应的限制性内切核酸酶消解后往往不能顺利地克隆到由同样的限制性内切核酸酶酶切的载体上 (Bennett and Molenaar 1994)。
材料与仪器
步骤
一、材料
1. 缓冲液与溶液
乙酸铵（10 mol/L)
氯仿
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V）
TE ( pH 8.0)
2. 酶与缓冲液
蛋白酶 K ( 20 mg/ml)
3. 凝胶
含 0.5 μg/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶
4. 核苷酸与寡聚核苷酸
经 PCR 扩增的 DNA 产物的纯化
5. 特殊设备
DNA 纯化树脂
水浴预先设置在 75℃
二、方法
1. 集中 8 支 PCR 反应管的反应液（约 400 μl），内含有目的基因扩增片段 1 μg。
若非特异性扩增产物明显地存在着（如从凝胶电泳上见到非特异性条带等)，可通过低融点凝胶电泳从电泳胶上回收纯化目的产物。
如果盛有 PCR 反应混合液的离心管上覆盖有一层矿物油，用于防止样品在反复热-冷循环中蒸发，收集反应混合液样品时应该先行离心，然后吸取下层水相液体于一个新的离心管内。
2. 加 0.2 倍体积的 5X 蛋白酶 K 缓冲液和终浓度至 50 μg/ml 的蛋白酶 K。温育反应混合液在 37℃ 水浴 60 min。
3. 用 75℃ 水浴 20 min 加热灭活反应混合液中的蛋白酶 K。
4. 反应混合液用酚: 氯仿与氯仿各抽提一次。
5. 用乙醇沉淀法回收 DNA 扩增产物。加 0.2 倍体积的 10 moI/L 乙酸铵与 2.5 倍体积的乙醇。充分混合液体后，在 4℃ 静止 30 min。
残留于 PCR 反应混合液中的 dNTP 能溶解于乙酸铵的乙醇溶液中，但不能随扩增的目的产物沉淀下来（Okayama and Berg, 1983)。
6. 用微量离心机于 4℃ 以高速（如 12000 g) 离心 5 min 以回收沉淀下来的 DNA。小心弃去上清液，然后用 1 ml 70% 乙醇于室温洗涤沉淀的样品，再次离心样品，弃去上清液，将离心管盖子敞开，置于室温，直至乙醇完全挥发。
DNA 样品可以进一步用填装树脂的层析柱进行柱层析纯化，如 Wizard PCR preps 纯化系统（Promga}、QIA qUick (Qiagen) 或凝胶电泳。这个步骤在通过 PCR 引物介导引入便于克隆的限制性内切核酸酶位点于扩增目的 DNA 片段的两末端时特别有必要。多余的引物二聚体应在用相应的限制性内切核酸酶进行酶切之前予以去除。
7. 将沉淀下来的 DNA 样品溶于 TE ( pH 8.0)。一般推测扩增 DNA 样品的回收率在 50%~80%，溶于 TE ( pH 8.0) 缓冲液中的 DNA 样品浓度配制成 25 μg/ml ( 25 ng/μl）。
8. 取纯化后的 DNA 样品约 25 ng，并配以相应大小及含量的 DNA marker 进行含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，根据扩增条带上的荧光强度鉴定 DNA 样品的实际含量，如果必要，可重新调整这种纯化后 DNA 样品的浓度值。
1. 缓冲液与溶液
乙酸铵（10 mol/L)
氯仿
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V）
TE ( pH 8.0)
2. 酶与缓冲液
蛋白酶 K ( 20 mg/ml)
3. 凝胶
含 0.5 μg/ml 溴化乙锭的琼脂糖凝胶
4. 核苷酸与寡聚核苷酸
经 PCR 扩增的 DNA 产物的纯化
5. 特殊设备
DNA 纯化树脂
水浴预先设置在 75℃
二、方法
1. 集中 8 支 PCR 反应管的反应液（约 400 μl），内含有目的基因扩增片段 1 μg。
若非特异性扩增产物明显地存在着（如从凝胶电泳上见到非特异性条带等)，可通过低融点凝胶电泳从电泳胶上回收纯化目的产物。
如果盛有 PCR 反应混合液的离心管上覆盖有一层矿物油，用于防止样品在反复热-冷循环中蒸发，收集反应混合液样品时应该先行离心，然后吸取下层水相液体于一个新的离心管内。
2. 加 0.2 倍体积的 5X 蛋白酶 K 缓冲液和终浓度至 50 μg/ml 的蛋白酶 K。温育反应混合液在 37℃ 水浴 60 min。
3. 用 75℃ 水浴 20 min 加热灭活反应混合液中的蛋白酶 K。
4. 反应混合液用酚: 氯仿与氯仿各抽提一次。
5. 用乙醇沉淀法回收 DNA 扩增产物。加 0.2 倍体积的 10 moI/L 乙酸铵与 2.5 倍体积的乙醇。充分混合液体后，在 4℃ 静止 30 min。
残留于 PCR 反应混合液中的 dNTP 能溶解于乙酸铵的乙醇溶液中，但不能随扩增的目的产物沉淀下来（Okayama and Berg, 1983)。
6. 用微量离心机于 4℃ 以高速（如 12000 g) 离心 5 min 以回收沉淀下来的 DNA。小心弃去上清液，然后用 1 ml 70% 乙醇于室温洗涤沉淀的样品，再次离心样品，弃去上清液，将离心管盖子敞开，置于室温，直至乙醇完全挥发。
DNA 样品可以进一步用填装树脂的层析柱进行柱层析纯化，如 Wizard PCR preps 纯化系统（Promga}、QIA qUick (Qiagen) 或凝胶电泳。这个步骤在通过 PCR 引物介导引入便于克隆的限制性内切核酸酶位点于扩增目的 DNA 片段的两末端时特别有必要。多余的引物二聚体应在用相应的限制性内切核酸酶进行酶切之前予以去除。
7. 将沉淀下来的 DNA 样品溶于 TE ( pH 8.0)。一般推测扩增 DNA 样品的回收率在 50%~80%，溶于 TE ( pH 8.0) 缓冲液中的 DNA 样品浓度配制成 25 μg/ml ( 25 ng/μl）。
8. 取纯化后的 DNA 样品约 25 ng，并配以相应大小及含量的 DNA marker 进行含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，根据扩增条带上的荧光强度鉴定 DNA 样品的实际含量，如果必要，可重新调整这种纯化后 DNA 样品的浓度值。
来源：丁香实验
