聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法

【实验目的】

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦的基本原理

2.学习用等电聚焦电泳测定蛋白质等电点的操作和方法

【实验原理】

等电聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。它的特点是在凝胶柱中加入两性电解质载体-Ampholine，从而使凝胶柱上产生pH梯度。当向两性载体凝胶施加电场时，即可形成pH梯度，pH梯度的顺序是从阳极到阴极pH值逐渐增大。

蛋白质为两性电解质，其所带电荷的性质和数量随所处环境的pH而变化。当蛋白质在等电聚焦凝胶柱中进行电泳时，带电荷的蛋白质离子即在凝胶柱上泳动：带负电荷的蛋白质分子向阳极移动，带正电荷的蛋白质分子向阴极移动。

当蛋白质样品泳动到凝胶的某一部位，这一部位的pH值正好相当于该蛋白质的等电点时，蛋白质的净电荷为零不再移动，则聚焦形成一条蛋白质区带。这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的方法称为等电聚焦。

利用这种方法，在蛋白质聚焦的相应位置测定凝胶的pH值，就可得知该蛋白质的等电点。

【实验材料】

1.实验器材

小玻璃管：内径0.5cm，长10cm 2支；小玻管架；圆盘电泳槽；注射器和长针头；移液管；pH计

2.实验试剂

(1) 两性电解质载体凝胶：丙烯酰胺3.5g，N-甲叉双丙烯酰胺0.1g，pH3～10的Ampholine 2.5ml，核黄素溶液（4mg/100ml）12.5ml，加水至50ml。

(2) 蛋白质溶液：纯牛血清白蛋白7mg，溶于1ml蒸馏水。此蛋白溶液应无盐离子。

(3) 5%磷酸溶液

(4) 2%氢氧化钠溶液

(5) 考马斯亮蓝R-250染色液：称取考马斯亮蓝R-250 0.25g，加入50%甲醇91ml和冰醋酸9ml。

(6) 40%蔗糖溶液

(7) 12%三氯醋酸溶液

(8) 脱色液 乙醇：冰醋酸：蒸馏水=25：10：65（v/v）。

【实验操作】

1. 取4ml两性电解质载体凝胶，置于抽气瓶中，加入0.07ml蛋白质溶液，轻轻摇动混匀，抽去气泡。

2. 取干净的小玻璃管2支，垂直放置，底端塞以橡皮塞，加入40%蔗糖溶液3～4滴，然后吸取抽气瓶中的两性电解质载体-蛋白质混合液1.8ml缓缓放入玻璃管中，加入胶液后立即用注射器加上一薄层水（3～5mm高），使混合液表面与空气隔绝。放置约0.5～1小时，观察凝胶的凝聚情况。

3. 管内凝胶凝聚后，用滤纸将顶端水吸去，小心拔去管底橡皮塞，让蔗糖溶液流出，并用少量蒸馏水清洗，然后将小玻璃管垂直放入圆盘电泳槽中。上槽加入5%磷酸溶液，接正极，下槽加入2% NaOH溶液，接负极，于150V条件下进行聚焦，过一段时间后（约2～3小时），电流稳定不变时（基本为零），说明聚焦完毕。

4. 聚焦结束后取出小玻璃管，迅速用蒸馏水将两端洗净。用一带长针头的注射器灌满蒸馏水，并将针头紧贴玻璃管内壁插至凝胶和管壁之间，转动玻璃管，同时推动注射器，并使针头在管壁与凝胶间前进，注入蒸馏水，使凝胶胶条从玻璃管中脱出。

5. 将其中一根凝胶胶条浸于12%三氯醋酸溶液中固定2小时，白色蛋白区带即出现。再浸于考马斯亮蓝染色液中染色5小时。取出后，转移至脱色液中脱去背景颜色。

6. 将另一根凝胶胶条按顺序切成0.5cm长的小段，分别浸泡于1.0ml蒸馏水中过夜，用pH计测定pH值。

【实验结果】

以凝胶胶条长度为横座标，pH值为纵座标，作图。
　　量出染色的各蛋白区带的距离，对照曲线查出其等电点。

【思考】

1. 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点的原理？
　　2. 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法操作时应注意的问题？