qPCR 问题集锦 之 武侠版 第一季第1集

师兄有云： 话说，那张无忌在山谷里练了五年九阳神功，相当于读了一 PHD

后来又在明教暗道里搞了个post-doc，出道立马名动江湖，打的第一份工就是接管了一个破落实验室。

接手实验室的第一天，无忌就发现手下小昭是个既有心机，又有城府的小姑娘，长得好看且不说，还有一身功夫，还精通八卦五行之术。但就是荧光定量 PCR 老是做不好。

一日，无忌君找到小昭

无忌曰：“小昭，你觉得现在做实验有什么困难么？”

小昭曰：“无忌哥，我好多问题，就是不知道从何说起。”

无忌曰：“没事儿，你尽管道来”

小昭曰：“无忌哥，普通PCR与荧光定量PCR技术区别？”

无忌曰：“简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。“

无忌曰：”前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了“...查看全文

小昭曰：“做实验时，是选择单通道实验还是多通道实验？”

无忌曰：”这是要根据实验需要来选择，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处就是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些...查看全文

小昭曰：“引物设计中都需要注意哪些事项呢？”

无忌曰：”1、 引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。

2、 引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域...查看全文

小昭曰：“那怎么做绝对定量，要不要做标准曲线哇？“

无忌曰：”大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2-ΔC'T来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定 量PCR扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2-ΔC'T 来计算了。这是错误的，会得到错误结论“..查看全文

师兄曰：自身的修炼固然重要，但是若配备有上等的装备，往往能使科研效率成指数性倍增，就像这里 → 传送门 ← 所提到的装备，真是惊天地泣鬼神。好吧今天的故事就到这里 。

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