• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        如何提取总蛋白?

        &英文特

        69962

        大家目前最常用的方法是利用溶液法进行蛋白提取(如 RIPA 裂解液),但是往往会在蛋白质提取中产生两个不同的组分,即 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性组分。通常 RIPA 不可溶性组分被我们直接丢弃忽略。但是已经有文章证实许多蛋白质存在于被丢弃的 RIPA 不可溶性组分中。也就是说利用溶液法提取的并非是完整的总蛋白,而仅仅是一些可溶性蛋白。

        溶液法进行提取蛋白时会人工激活 caspase-3 和 caspase-7;还会人工激活某些激酶活性;影响磷酸化研究;影响细胞外基质;影响定量,定性蛋白研究。目前利用离心管柱式法进行蛋白提取,即可解决以上这些问题,只需加入裂解液,过柱离心,不产生不可溶组份,即可提取到完整的总蛋白!

        动物组织总蛋白提取

        变性总蛋白提取(SD-001)

        以下步骤是从 15-20 mg 组织中提取,对于昆虫组织,例如果蝇,使用 15-20 个幼虫,蛹或成虫样本。如果起始量较大或者较小,需调整相应裂解液的用量比例。

        1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

        2. 将 15-20 mg 组织放置于离心管柱上,用塑料棍扭转研磨 50-60 次,加入 200ul 细胞裂解液,继续研磨 30-60 次。(组织用量不要过量,无需过度研磨,裂解液可分两次加入以得到最佳效果)注意:塑料研磨棒可以重复使用,用蒸馏水彻底冲洗干净,用纸巾擦干。

        3. 盖上盖子室温孵育 1-2 分钟,14000-16000rpm 离心 1-2 分钟取出。

        4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。
        请注意:部分未完全裂解的组织不会影响样品质量。

        天然总蛋白提取(SN-002)

        1. 将天然细胞裂解液(SN-002),离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

        2. 将 15-20 mg 组织放置于离心管柱上,用塑料棍扭转研磨 50-60 次,加入 200ul 天然细胞裂解液(SN-002),继续研磨 30-60 次。(组织用量不要过量,无需过度研磨,裂解液可分两次加入以得到最佳效果)。注意:塑料研磨棒可以重复使用,用蒸馏水彻底冲洗干净,用纸巾擦干。

        3. 开盖冰上孵育 5 分钟,盖上盖子,4℃,14000-16000rpm 离心 1-2 分钟取出。

        4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

        细胞样品总蛋白提取

        变性总蛋白提取(SD-001)

        A.非贴壁细胞

        1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

        2. 低速离心收集细胞,在 1.5 ml 离心管中加入预冷的 PBS,旋窝震荡,3000rpm 离心 2-3 分钟清洗细胞。吸去上清,剩余与细胞体积相同体积的 PBS。涡旋震荡重悬细胞。

        3. 加入表格 1 中相应体积的细胞裂解液,涡旋震荡裂解细胞。(细胞数量和裂解液须保证对应关系,以达到最佳提取效率)请注意:部分未完全裂解的细胞不会影响样品质量。

        4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000rpm 离心 30 秒取出

        5. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

        表格 1,不同细胞体积应加入相应体积裂解液

        细胞体积(ul)

        裂解液(ul)

        相当细胞量# X 106

        3

        20

        0.3

        5

        50

        0.5

        10

        100

        1

        20

        200

        2

        40

        500

        3

        ﹡ NIH3T3 和 293T 细胞 10ul 体积相当于 1X106 个细胞

        B. 贴壁细胞

        1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

        2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板,培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞,吸去上清。

        3. 按照表 2 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面,用移液器吹打几次,将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000rpm 离心 30 秒取出。(如提取浓度不佳,可减少裂解液使用量)

        4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

        表格 2,不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液

        器皿

        细胞数量

        裂解液(ul)

        24孔板

        0.1-0.2 Million

        50

        6孔板

        0.6-0.8 Million

        200

        25 cm2培养瓶

        1.5-2 Million

        500


        天然总蛋白提取(SN-002)

        A.非贴壁细胞

        1. 将天然细胞裂解液(SN-002),离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

        2. 低速离心收集细胞,在 1.5 ml 离心管中加入预冷的 PBS, 旋窝震荡,3000rpm 离心 2-3 分钟清洗细胞。吸去上清,剩余与细胞体积相同体积的 PBS。旋窝震荡重悬细胞。

        3. 加入表格 3 中相应体积的细胞裂解液,涡旋震荡裂解细胞 15 秒。将离心管放置于冰上 3-5 分钟然后涡旋震荡 10 秒。(细胞数量和裂解液须保证对应关系,以达到最佳提取效率)

        4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000rpm 离心 30 秒取出

        5. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

        表格 3,不同细胞体积应加入相应体积裂解液

        细胞体积(ul)

        裂解液(ul)

        相当细胞量# X 106

        3

        20

        0.3

        5

        50

        0.5

        10

        100

        1

        20

        200

        2

        40

        500

        3

        ﹡ NIH3T3 和 293T 细胞 10ul 体积相当于 1X106 个细胞

        B 贴壁细胞

        1. 将天然细胞裂解液(SN-002),离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

        2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板,培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞两次,吸去上清。

        3. 按照表 4 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面,放置于冰上孵育 5 分钟,用移液器吹打几次,将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中,14000-16000rpm 离心 30 秒取出。(如提取浓度不佳,可减少裂解液使用量)

        4. 立刻将收集管放置于冰上,弃去离心管柱,蛋白提取完成可应用于下游实验。

        表格 4,不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液

        器皿

        细胞数量

        裂解液(ul)

        24孔板

        0.1-0.2 Million

        50

        6孔板

        0.6-0.8 Million

        250

        25 cm2培养瓶

        1.5-2 Million

        500

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序