【资源】Chip Q-PCR定量分析方法分享

丁香园论坛2015-06-29

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Q-PCR定量分析CHIP

最近做了CHIP，用Q-PCR方法进行定量分析，现将我对一些文献资料的总结传上，希望对大家有帮助！

i. Normalizeeach ChIP DNA fractions’ Ct value to the Input DNA fraction Ct value
for the same qPCR Assay (ΔCt) to account forchromatin sample preparation
differences.
ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)))
Where, Input Dilution Factor = (fraction of theinput chromatin saved)-1
Average normalized ChIP Ct values for replicate samples.
ii. Calculate the % Input for each ChIP fraction(linear conversion of the normalized
ChIP ΔCt).
% Input = 2 (-ΔCt [normalized ChIP])
iii. Adjust the normalized ChIP fraction Ct valuefor the normalized background
(NIS/mock IP) fraction Ct value (first ΔΔCt).
ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt[normalized NIS/mock]
iv. Calculate Assay Site IP Fold Enrichment abovethe sample specific background
(linear conversion of the first ΔΔCt).
Fold Enrichment = 2 (-ΔΔCt [ChIP/NIS])
v. Determine the difference between the normalizedexperimental sample (S2) and
the control sample (S1) ChIP fraction Ct values(second ΔΔCt).
ΔΔCt [S2-S1] = ΔCt [S2:normalized ChIP] - ΔCt[S1:normalized ChIP]
vi. Calculate Differential Occupancy Fold Change(linear conversion of the second
ΔΔCt to yield a fold change in site occupancy).
Fold Change in Occupancy = 2 (-ΔΔCt [S2-S1])

ChIP完定量的计算方法：
1）双△CT法；
2）双标准曲线法。

Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用：

1. Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。
2. 每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。
用ComparativeDelta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。
双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。

双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用：

1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优化。
2. 其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。
并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。
每种相对定量方法都会有一定的局限性，对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta- delta Ct法更为简单。

双△CT法：
1. 标准化DNA的量 Normalize DNA.
ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)))
Input Dilution Factor = (fraction of the inputchromatin saved) -1 (-1次方)
2. 计算百分比
% Input = 2 ^(-ΔCt [normalized ChIP])
对于后面的问题，还要有一些计算，
3. 要加入阴性对照的Ct值
ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt [阴性]
4. 计算Assay Site IP Fold Enrichment
Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP/NIS])
5. S1和S2的比值计算
ΔΔCt [S2-S1] = ΔCt [S2:normalized ChIP] - ΔCt[S1:normalized ChIP]
6. 样品比值= 2 ^(-ΔΔCt [S2-S1])
请注意以上2之后为指数，fraction of the input chromatin saved指input在样品总体中的比例，如你在1ml 总DNA中取10ul，那么这个比例就为1%, Input Dilution Factor=100

如所得的数据如下：实验组（S2）和对照样本（S1）
实验组（S2）：其Ct值，Input为27.674; 目标蛋白30.239; 阴性对照31.983; Input稀释倍数（从1000ul体积中取了80ul作为input），
对照样本（S1）:其Ct值，Input为25.63; 目标蛋白31.935; 阴性对照33.14; Input稀释倍数（从1000ul体积中取了80ul作为input）。

双△CT法：
1. 标准化DNA的量 Normalize DNA.
ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)))
Input Dilution Factor = (fraction of the inputchromatin saved) -1 (-1次方)
S1： ΔCt [normalized ChIP] = [30.239-(27.674 –log2 (12.5)) ]
= 3.662
S2： ΔCt [normalized ChIP] = [31.935-(25.63 – log2(12.5)) ]
= 7.402

2. 计算百分比
% Input = 2 ^(-ΔCt [normalized ChIP])
S1: % Input = 2 ^(-3.662) = 0.079 = 7.9%
S2: % Input = 2 ^(-7.402) = 0.006 = 0.6%

3. 要加入阴性对照的Ct值
ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt [阴性]
S1: ΔΔCt [ChIP/NIS] = 3.662- 31.983 = -28.321
S2: ΔΔCt [ChIP/NIS] = 7.402- 33.14 = - 25.738

4. 计算Assay Site IP Fold Enrichment
Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP/NIS])
S1: Fold Enrichment = 2^(28.321) = 335328531
S2: Fold Enrichment = 2^(25.738) = 55964165

5. S1和S2的比值计算
ΔΔCt [S2-S1] = ΔCt [S2:normalized ChIP] - ΔCt[S1:normalized ChIP]
ΔΔCt [S2-S1] = 7.402- 3.662= 3.74

6. 样品比值= 2 ^(-ΔΔCt [S2-S1])
样品比值= 2 ^(-ΔΔCt[S2-S1]) = 2^3.74 = 13.36

计算出来的过程应该是这个样子的，需要指出的是，由于论坛排版的问题，log2是以2为底的log，不是2×Ct，呵呵。