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        真菌染色——六胺银法

        相关实验:真菌检测实验

        最新修订时间:

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        合作专家 | 雷庆强硕士

        免疫学 四川大学

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        审核专家 | 曾倩晖博士

        动物遗传育种繁殖 华中农业大学

        简介

        六胺银染色又称(Periodic-acid silver methenamine)PASM 染色。标本经高碘酸氧化后,使真菌和其他机会性生物的细胞壁内的粘多糖暴露出醛基,醛基将六胺银还原为黑色的金属银。硫代硫酸钠对已显色的银盐起固定作用,并除去未反应的银离子。

        原理

        用高碘酸与组织发生氧化,使组织的基底膜或真菌内的粘多糖暴露醛基,醛基与六胺银发生作用,将其还原成黑色的金属银,再利用硫代硫酸钠除去未反应的银离子。

        用途

        主要用于组织基底膜和真菌(主要应用于新型隐球菌、毛霉菌、曲霉菌、组织胞浆菌、马尔尼菲青霉菌、放线菌等)的染色。

        材料与仪器

        ① 5% 硼砂水溶液:硼砂 5 克,溶解于 100 毫升的蒸馏水中

        ② 5% 硝酸银水溶液:硝酸银 5 克,溶解于 100 毫升的蒸馏水中

        ③ 3% 乌洛托品水溶液:乌洛托品 3 克,溶解于 100 毫升的蒸馏水中

        ④ 六胺银贮备液:3% 乌洛托品水溶液倒入 5% 的硝酸银液中,产生白色沉淀,摇荡变清亮,4 ℃ 避光保存,可保存约 6 个月。

        ⑤ 应用液:取贮备液 25 毫升,回至室温,加 5% 硼砂水溶液 5 毫升,现用现配

        ⑥ 5% 铬酸水溶液:铬酸 (chromic acid)5 克,蒸馏水 100 毫升

        ⑦ 1% 亚硫酸氢钠水溶液: 亚硫酸氢钠(Sodium bisulfite)1 克,蒸水 100 毫升

        ⑧ 0.05% 淡绿染液:淡绿 0.1 克,蒸馏水 200 毫升,醋酸 0.1 毫升

        ⑨ 0.1% 氯化金水溶液:氯化金 0.1 克,溶解于 100 毫升的蒸馏水中

        ⑩ 3% 硫代硫酸钠水溶液:硫代硫酸钠 3 克,溶解于 100 毫升的蒸馏水中

        步骤

        1、切片常规脱蜡至水洗。

        2、然后将切片放入 5% 铬酸水溶液 1小 时,自来水冲洗 5 分钟。

        3、随后将切片放入 1% 亚硫酸氢钠30分钟,自来水冲洗 3 分钟,蒸馏水充分洗涤。

        4、六胺银应用液首先预热至 60 °C,然后将切片放入配制好的预热的六胺银工作液中 1 小时,切片呈淡黄色即取出经水洗后显微镜观察有否有菌体出现。

        如有淡棕色菌体出现,应每隔 5~10 min 观察一次以控制菌体着色深浅,直至显色理想。随后蒸馏水洗 5~6 次。

        5、再将切片放入 0.1% 氯化金水溶液调色 4 分钟,蒸馏水洗 1~2 分钟。

        6、随后将切片放入 3% 硫代硫酸钠水溶液 5 分钟。

        7、自来水洗 1 分钟,蒸馏水洗 1 分钟。

        8、淡绿复染 20 秒,流水冲洗 20~60 秒。

        9、95% 酒精和无水精脱水,二甲苯透明,树胶封片。

        10、染色结果:真菌黑色,背景浅绿色。

        注意事项

        1、挑取样本制成涂片,涂片时必须注意细心操作,涂片薄而均匀。制备的涂片应自然干燥,若采取加热固定,固定温度不宜过高,以玻片背面接触手背不烫为准,否则可能使标本的形态改变影响观察结果。

        2、氯化金调色时,一定要在显微镜下观察。

        3、实验中所用玻璃器皿,应预先用硫酸洗液浸泡并用蒸馏水冲洗干净,烤干。

        来源:丁香实验

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