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        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        德国IBA Lifesciences

        2291

        ​免疫亲和层析法常用于蛋白质等生物大分子的纯化。但你是否想过,一根亲和层析柱子也能用来进行细胞分选,而且还不使用高亲和力抗体?

        免疫亲和层析细胞分选的技术原理
         

        在细胞分选中,我们常常利用免疫识别特性来进行,比如流式分选 (FACS)和免疫磁分选 (MACS)。

        免疫细胞的划分是依据表面标志 CD 分子,可以被抗体识别。比如针对 CD4 + T 细胞这一特定类群,表面含有 CD45、CD3 和 CD4 标记。而表达 CD4 就是辅助性 T 细胞的特征。

        由此而来,免疫磁分选利用特定抗体偶联磁珠来捕获细胞。细胞与磁珠结合后,再利用磁分离器来分选。但具体选用何种方法,还是要看下游的研究。如果,想在选出的 CD4 +T 细胞上做基因功能研究,就不能采用会影响靶细胞基因表达或者会刺激细胞的方法,还得获得大量高纯度、高活力的细胞

        而高亲和力抗体的使用,则不免对细胞产生刺激。

        免疫亲和层析细胞分选的技术原理
        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

         

        如果为了避免刺激细胞,不使用高亲和力抗体,细胞分选该如何进行呢?

         

        无踪免疫亲和层析(TACS)细胞分选

        对于这个问题,来自德国 IBA Lifesciences 的团队考虑到了亲和层析法。

        进行蛋白纯化最常用的方法之一,是亲和层析法,借助标签和配体的亲和力进行蛋白纯化。纯化的重组蛋白通常能以特异性的方式被洗脱,例如,在 Strep 标签蛋白纯化中,加入生物素(biotin)即可断开 Strep 标签与配体 Strep-Tactin 的作用,达到有效洗脱的目的。得到高纯度有活性的蛋白质应用在多种下游实验中,如研究蛋白质间相互作用等。

        那么是否可以以此为基础,将标签配体亲和力加以利用,结合免疫识别特性,用温和的方法得到高纯度的目的细胞呢?

         

        1、「画龙点睛」的表位标签——Fab-Streps

        抗体具有高度特异性,按照功能划分的抗体有 Fab 区和 Fc 区。其中的 Fab 是抗原结合片段,对特异性抗原有亲和力 (affinity)。

        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        如果避免使用高亲和力抗体,可以考虑选取抗体上的 Fab 片段。将 Fab 与亲和 Strep 标签融合后,得到的表位标签 Fab-Streps,留有抗体-抗原相互作用,还具备标签-配体相互作用。

        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        Fab-Streps 的 Fab 段既对目的细胞的特异性 CD 标记有着亲和力,能抓取目的细胞;Strep 段又能结合亲和层析中,固定在多种介质上的配体 Strep-Tactin,如重力柱,磁珠,荧光等,一举两得。

        这样一个能应用于细胞分选的无踪免疫亲和层析方法称为 Fab-TACS (Fab-based traceless affinity cell selection)

        免疫亲和层析细胞分选的技术原理
         

        2、「无踪label-free 细胞分选

        除了能避免使用全长抗体在分选时对细胞的刺激外,这样建立的免疫亲和层析细胞分选方法有一个重要特性, 就是分选试剂可逆,从而也避免了分选后磁珠附着在细胞上的可能。

        从 Strep-tag 系统着手,充分利用了其温和可逆,高纯度的特点。这样的选后细胞表面不带「抗体标记」,为 label-free,从而避免了对下游实验的影响,如流式染色,体内、体外实验等。

        免疫亲和层析细胞分选的技术原理


        3、简易的分选步骤

        亲和层析法的分选细胞的步骤是怎样进行的呢?其实和蛋白纯化并无明显区别。

        这里以使用重力柱的 Fab-TACS分选为例:

        通过 加入 Fab-Streps-加样-清洗-洗脱,完成目的细胞的分选。洗脱步骤中,加入生物素(biotin)即可作为竞争剂断开相互作用。

        Step1 加入 Fab-Streps
        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        Step2 加入样品
        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        Step3 清洗
        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        Step4 洗脱
        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        收集目的细胞
        免疫亲和层析细胞分选的技术原理
         

        4、Fab-TACS 免疫亲和层析细胞分选技术优势

        这样结合了抗体高特异性与层析的分选方法,具有的优点如下:

        • 实验流程简单快速
        • 细胞上没有试剂残留
        • 选后目的细胞不受刺激
        • 免去费时的离心步骤
        • 可以直接从全血等其他血液样本进行分选
        • 每根重力柱可处理多达 50 ml 全血
        • 可根据细胞量自由搭配试剂盒


        5、实验数据

        当应用于 CD3 +T人/小鼠细胞分选时,实验数据为怎样呢?

        实际测试之后,同样以亲和层析重力柱分选为例,从 CD3 + Fab-Streps 和 Strep-Tactin-TACS® 琼脂糖柱中,从血沉棕黄层或鼠脾细胞中分离出 CD3 + T 细胞。 评估纯度,产率和活率。

        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        从血沉棕黄层(A,n = 10)或鼠脾细胞(B,n = 7)中分离 CD3 +细胞。 数据平均值±SEM 表示。 通过流式细胞仪分析细胞。 富集前后的代表性 FACS 如图 C(人)和 D(小鼠)显示。 根据 DAPI 染色排除死细胞。 分离的人 CD3 + T 细胞的平均纯度为 96%,而分离的小鼠 CD3 + T 细胞的平均纯度为 91%。

        免疫亲和层析细胞分选的技术原理
        免疫亲和层析细胞分选的技术原理

        分选后,人和小鼠样品中约有 85% 的 CD3 +细胞被回收。从血沉棕黄层分离后,平均有 99% 的细胞存活,鼠脾细胞样品平均有 91% 的细胞存活。

        目前,IBA Lifesciences 推出的 Fab-TACS 无踪免疫亲和层析技术,提供完善的细胞分选解决方案,支持从多种的血液样品,如全血,buffy coat,PBMCs,单细胞悬液,小鼠脾脏等。提供基于荧光、磁珠、重力柱等多种形式的灵活选择,适应不同的细胞量。还能自己随心搭配想要的试剂盒,自由根据实验所需进行选择!

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