• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        人源 Treg 和 Tresp 细胞分选实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        1. 分离缓冲液
          1× PBS (pH 7.2), 0.5% BSA, 2 mM EDTA 或者 6×1.5 L autoMACS® Running Buffer – MACS® Separation Buffer
        2. T 细胞分选试剂盒
          人源 CD4+CD25+ Treg 细胞分离试剂盒 (# 130-091-301)
        3. 磁选分离
        • LD 分选柱,1×108 标记细胞 X1  (# 130-042-901)
        • MS 分选柱,X2 (# 130-042-201)
        • MidiMACS™ 分离器(适用于 LD 分选柱) (# 130-042-302)
        • MiniMACS™ 分离器(适用于 MS 分选柱) (# 130-042-102)
        • MACS MultiStand (# 130-042-303)
        • (可选) 预分离滤器 (30 µm) (# 130-041-407)

        步骤

        一、磁珠标记非 CD4+ 细胞

        1. 细胞计数
        2. 细胞悬液 300xg 离心 10min,去上清
        3. 细胞重悬,每 1×107 细胞 90ul 分离缓冲液
        4. 每 1×107 细胞添加 10ul CD4+ T 细胞生物素-抗体鸡尾酒
        5. 混匀,于 2-8℃ 中孵育 5min
        6. 每 1×107 细胞添加 20ul 抗生物素磁珠
        7. 混匀,于 2-8℃ 中孵育 10min 非 CD4+ 细胞
        8. 添加分离缓冲液调整溶液体积至 500ul(注:500ul 体积中最大重悬至 1×108 细胞,对于更多的细胞数量,需要相应的提高缓冲液体积)。

        二、磁珠去除非 CD4+ 细胞

        • Treg 细胞分离第一步就是去除非 CD4+ 细胞。该步骤推荐使用 LD 柱,具有 1×108 标记细胞和 5×108 总细胞的细胞容量。
        • 当使用 CD4+/CD25+ Treg 细胞分离试剂盒时,人源试剂盒不推荐在 LD 分选柱上处理超过 1.3×108 上样细胞总量。如果超过这个上样细胞总量,强烈推荐分离样本使用另外的 LD 分选柱。
        1. 将 LD 分选柱放入 MidiMACS™ 分离器中的磁场中
        2. 用 2ml 分离缓冲液冲洗分选柱,等到分选柱排空后再进行下一步操作
        3. 将制备好的细胞悬液加入分选柱中
        4. 收集通过的未标记细胞,分别用 1ml 分离缓冲液清晰柱子两次(注:收集流穿部分,这是用于进一步 Treg 和 Tresp 细胞分离所需的未标记的预富集的 CD4+ 细胞溶液)
        5. 细胞计数。

        三、磁珠标记 CD25+ 细胞

        • 磁珠分选体积的最大初始细胞量为 1×107 细胞,更高的细胞量需要相应地提高所有体积
        1. 细胞悬液 300xg 离心 10min,去上清
        2. 细胞重悬,每 1×107 细胞 90ul 分离缓冲液
        3. 每 1×107 细胞添加 10ul 抗生物素磁珠 Ⅱ
        4. 混匀,于 2-8℃ 中孵育 15min
        5. 添加 1-2ml 分离缓冲液清洗细胞,300xg 离心 10min,去上清
        6. 添加分离缓冲液调整溶液体积至 500ul(注:500ul 体积中最大重悬至 1×108 细胞,对于更多的细胞数量,需要相应的提高缓冲液体积)。

        四、磁珠分离 CD25+ 细胞

        • Treg 和 Tresp 分选的第二步就是阳选 CD25+ 细胞。该步骤中,我们使用两个连贯的具有 1×107 标记细胞容量的 MS 分选柱。为了不超过这个容量限制,建议先通过流式细胞术测定细胞悬液中 CD25+ 细胞的浓度。
        • 为了评估分离得到的 Treg 和 Tresp 细胞的纯度,必须进行细胞流式分析。有关详细实验方案,请参阅「Treg 和 Tresp 细胞的表面免疫荧光染色和细胞流式分析」。
        1. 将 MS 分选柱放入 MidiMACS™ 分离器中的磁场中
        2. 用 500ul 分离缓冲液冲洗分选柱
        3. 将制备好的细胞悬液加入分选柱中,收集含有未标记 Tresp 细胞(CD4+/CD25-)的流出溶液
        4. 分别用 500ul 分离缓冲液清洗柱子 3 次,收集通过的未标记细胞和上一步所收集的溶液混合
        5. 将分选柱从分离器上取下,置于合适的收集管中
        6. 添加 1ml 分离缓冲液到柱子上,立即将柱塞推入柱中,冲洗出磁性标记细胞
        7. 为了提高 CD4+CD25+ 细胞的纯度,洗脱的部分可以在第二个 MS 分选柱上富集(推荐)。使用新的 MS 柱重复步骤 1 至 6 中所述的磁分离操作。分离得到的 Treg 和 Tresp 细胞可以用于体外抑制分析。

        注意事项

        1. 分选用到的最大体积为 1×107 细胞,使用少于这个量的细胞时,按照指示使用相同的体积;当使用更大的细胞量时,试剂用量和总体积都要相应扩大。例:对于 2×107 上样细胞总量,对应的试剂体积和溶液总体积都为两倍)。
        2. 当使用抗凝血剂外周血或 buffycoat 时,应通过密度梯度离心分离 PBMC,例如使用 Ficoll-Paque™,收集 PBMC 样品,用于随后的流式细胞仪分析。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序