用全血直接分选 CD3+ T 细胞

免疫亲和层析是以 Fab 片段为基础的无痕亲和细胞分选技术（traceless affinity cell selection, Fab-TACS）。Fab-TACS 运用免疫亲和层析的原理，使用细胞表面抗原分子 CD marker 中的 Fab 片段来进行捕捉及释放目的细胞。以抗体的 Fab 片段取代一般具有高亲和力的完整抗体，实现试剂与细胞的可逆结合，直接从全血或其他血液样本中分选目的细胞。

Fab-TACS 柱子填充了包被有 Strep-Tactin^® 多聚体的细胞级琼脂糖基质，偶联上 Strep-tag 的 Fab 片段（Fab-Streps）特异性的结合到琼脂糖基质上。随后，加入全血或其他血液制剂流过柱子。目的细胞通过特异性的 Fab-Strep 作用从而结合到琼脂糖基质上，其他非目的细胞则有效的被洗去。最后，加入生物素使目的细胞从 Fab-Streps 上解离。至此，就已分离得到不带任何标记的、真实的目的细胞可用于下游的实验研究。

 

1. 实验流程

所需产品：

CD3 Fab-TACS^® Gravity Kit, human（IBA Lifesciences, Cat. no.: 6 - 6201 - 004），內含 :

4x Fab-TACS^® Gravity column (capacity pro column: 15 ml whole blood)

1x CD3 Fab-Strep, human

1x Buffer CI (10x)

1x Biotin stock solution

1x Fab-TACS^® Gravity Adapter

Fab-TACS^® Flow Restrictor, Pack of 5

 

1.1 用 ddH2O 将 10× Buffer CI 稀释至 1×；

1.2 用 1 ml Buffer CI 溶解冻干粉的 Fab-Strep，用移液器反复吹打，不能涡旋！溶解后的 Fab-Strep 进行分装保存（可 200µl 每管），冻存于- 20°C，避免反复冻融；

1.3 往 200µl 溶解后的 Fab-Strep 中，加入 800µl 的 Buffer CI 。此时，Fab-Strep 溶液已准备好，可直接使用了；

1.4 加入 200µl 100 mM 的生物素至 20 ml Buffer CI 中，混匀；

1.5 稀释全血，全血：Buffer CI = 3:1。例如：9 ml 外周血加入 3 ml Buffer CI 进行稀释，混匀。为了移除团块，可将稀释后的全血过 40µm 的筛网；对于 PBMCs 样本，用 Buffer CI 重悬 PBMCs 至浓度为：3x108 cells/ 5 ml

1.6 移除柱子上的帽子，剪掉柱子下端。将柱子放置于 Adapter 上，让柱子中的液体流尽；

1.7 柱子中加入 5 ml 的 Buffer CI，完全流尽，下面用离心管接住；

1.8 往柱子中加入 1 ml 2.3 中准备好的 Fab-Strep，让其自动往下流（孵育时间是足够 2 分钟的）；

1.9 加入2 ml Buffer CI洗柱子。更换下面接废液的离心管，至此柱子就准备好了；

1.10 将前面稀释好的血液加入柱子中，一次最多加入 5 ml（为了提高得率，可通过使用 restrictor 来降低流速），并收集血液。每根柱子能承受的全血量请参考对应的说明书

1.11 过完全血后，用 4×10 ml 的 Buffer CI 洗 4 次柱子；

1.12 更换下面接液流的离心管，收集目的细胞。加入 1 ml 2.4 中准备好的 Biotin Elution Buffer，让液流完全进入胶体后孵育 2 min，加入 9 ml 的 Biotin Elution Buffer；

1.13 对于从全血中分选目的细胞，再加入 10 ml 的 Biotin Elution Buffer；

1.14 300 g 转速离心 10 分钟，收集洗脱目的细胞。

 

流程图：

 

2. 实验数据
以下流式图为从 7.5 ml 全血中，选出 CD3 + T 细胞的数据。选后细胞以 CD3 -APC (OKT- 3) 及 CD45 -PE (HI30，白细胞标志) 抗体染色后，进行流式分析，死细胞以 DAPI 染色先行排除，左右分别为分选前后的细胞群分布。

 

总结：
几次实验的结果，使用 Fab-TACS^® Gravity column 来从全血直接进行 CD3⁺ T 细胞分选，平均得率为 84.5%，纯度大于 90%，细胞存活率高于 95%，且目标细胞不含标记，贴近天然，使下游实验更精确。