浅谈 RNA 测序：从阿尔茨海默症相关星形胶质细胞的发现说起

丁香学术2021-09-09

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非神经元细胞在阿尔茨海默症（Alzheimer's Disease, AD）病理进展中的作用尚未完全阐明。在一项美国麻省理工学院和哈佛大学广泛研究所合作的研究中，研究人员通过单核 RNA 测序（single-nucleus RNA sequencing）技术，鉴定出了 AD 小鼠模型中与疾病相关的新型星形胶质细胞，为阿尔茨海默症的病理进展提供了细胞基础。

该研究发现，与疾病相关的星形胶质细胞出现在阿尔茨海默症的早期阶段，并随着疾病的发展而增加。同时发现类似的星形胶质细胞也在衰老的野生型小鼠和衰老的人脑中出现，表明它们与遗传和年龄相关因素有关。

许多研究发现，AD 发生后星形胶质细胞在神经胶质细胞病变过程中发挥着重要的作用。但是疾病状态下可能存在不同的星形胶质细胞表型，并且对于疾病的进展作用可能有所不同。因此，星形胶质细胞和其他非神经元细胞的高分辨率表征可以帮助鉴定参与 AD 发病机理的新型细胞成分。

1. 利用单核 RNA 测序发现与 AD 相关的新型星形胶质细胞（Disease Associate Astrocyte, DAA）

该研究利用 sNuc-seq 技术建立海马区的细胞分子图谱，使用两种不同的方法全面捕获跨细胞类型的细胞核。在 AD 模型小鼠中，发现了一种新的星形胶质细胞，为 GFAP 高表达状态，称其为疾病相关的星形胶质细胞。

在雄性和雌性的 AD 模型小鼠中都观察到了 DAA 的存在。相较于 WT 小鼠，DAA 的出现伴随着低 GFAP 表达星形胶质细胞群体的显著减少。在 WT 和 AD 模型中均观察到高 GFAP 的星形胶质细胞群和 AD 中独特的 DAA 群，两者共享大量上调的基因。

高 GFAP 群和 DAA 群中参与发育、分化、代谢途径（脂质，胆固醇），以及炎症信号传导的基因均表达上调。值得注意的是，在 AD 和 WT 中都发现高 GFAP 星形胶质细胞群，特异性表达了与血管相关的星形胶质细胞的标记物，例如 Aqp4。DAA 表达了一组独特的基因，包括参与胞吞作用、补体级联和衰老的基因。

为将 DAA 与先前描述的星形胶质细胞特征相关联，该研究检测了来自大数据的 RNA 集。发现与野生型相比，AD 模型小鼠中，星形胶质细胞总体上具有广泛反应性，炎症相关的 A1 星形胶质细胞表达增加，但 A2 型星形胶质细胞信号没有显示增加。

通过在 WT 和 5xFAD 动物的海马中共染色 GFAP、SERINA3N 和 VIM（分别是反应性星形胶质细胞和神经干细胞的标记），验证了 DAA 在蛋白质水平上的存在并表征了它们的空间分布（图 1e，1f）。

在 5xFAD 小鼠中观察到 GFAP+、 SERPINA3N+、 VIM+ 的星形胶质细胞，并且高度集中于下丘脑，但在 WT 小鼠中未观察到，这与 sNuc-seq 谱图一致。在野生型小鼠中，在齿状回中发现了 VIM+ 细胞，这也与已知的结论相一致。

图 1. DAA 与多种分子途径相关，AD 模型中位于 Aβ 斑块附近

图片来源：nature neuroscience

为了确定疾病进展过程中变化的发生方式，该研究通过 sNuc-seq 对不同年龄的 AD 和 WT 小鼠（1.5–2、4–5、7–8、10、13–14、20 个月）进行测定。从 4 个月开始，在所有测试时间点，AD 小鼠模型大脑中的小胶质细胞频率均高于 WT，并随年龄增加而增长（图 2b）。

该研究设计了一种计算程序构建了细胞相关分布图，以推断细胞状态之间的转变，并找到了最佳全局分配，以在给定的时间点将每个 AD 星形胶质细胞匹配到一个最近的邻居，称为起源细胞（图 2e）。

对于每个群集，计算其他群集中原始细胞的频率，通过将原始细胞到真实位置的平均运动与基因相关联，提取出最紧密相关的基因。这些最重要的基因揭示了一组独特的 DAA 标记（图 2h），并确定了一组在转基因过程中被激活或抑制的基因。

最后，研究人员在人类的衰老大脑中寻找 DAA 或类 DAA 细胞的证据（图 2c，d，i），鉴定出了与三种小鼠模型中发现的状态相似的星形胶质细胞群，包括在患有 AD 的个体中以较高频率出现的 DAA 样细胞（图 2i）。表明作者的发现可能与人类衰老疾病有关。

图 2. DAA 来自稳态 GFAP 低表达的星形胶质细胞，其数量随着年龄增长而增加

总体而言，使用来自 34 个年龄段的 WT 和 5xFAD 小鼠的 sNuc-seq 谱，作者发现了星形胶质细胞中的一种疾病特异性状态，该细胞状态出现的时间较早，并且其数量随着疾病的进展而增加。

在人类和野生型小鼠的大脑中，DAA 种群也随着衰老而出现。这与先前有关淀粉样斑块激活星形胶质细胞的报道一致，在海马和下丘脑的淀粉样斑块附近发现表达 DAA 标记的星形胶质细胞。

该研究推测这些细胞的动态变化可能始于胶质细胞增生，试图通过区分出健康神经元中积累的错误折叠蛋白，从而遏制损伤。炎症和神经毒性特征（包括 SerpinA3N）的表达会对疾病进展造成破坏，可能会干扰斑块的降解。

值得注意的是，动态星形胶质细胞反应可能涉及环境因素以及微环境中存在的各种细胞（包括小胶质细胞）之间的干扰。该研究的创新点在于，经过生物信息学分析，着重显示了疾病相关的星形胶质细胞（DAA）和疾病相关小胶质细胞（DAM，disease-associated microglia）的上调的基因间的相同群体特征，也提醒我们不同疾病条件下跨细胞类型的共享特征和通用的病理状态下的转录程序。

但目前仍需要进一步研究充分了解 DAA 的作用，并确定该星形胶质细胞状态是普遍存在的还是与淀粉样蛋白相关。了解 DAA 在疾病进展中的不同活性，给新的治疗靶点的发现提供了途径，比如增强 DAA 的有益作用，可能具有改善疾病的潜力。

2. RNA 测序技术

该研究利用的是单核 RNA-seq 技术，提取细胞核中的基因组进行测序分析。第二代 RNA-seq 技术广泛应用于各个领域，用来分析 RNA 数据。

通过提取组织细胞核获得转录本数据，利用比对软件（如 HISAT）将 reads 比对到参考基因组上，之后进行转录本的组装重构并获得预计表达水平。重构后得到每个样品中所有的转录本序列，之后将这些转录本与已知的 mRNA 及目的 RNA 进行比较，获得它们相互位置关系的信息并进行筛选，之后进行靶基因的预测。

在得到 RNA 靶基因后，进行差异表达分析，从而筛选出差异表达物，后续进行样品聚类和相关性分析，样品间基因表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标。相关系数越接近 1，表明样品之间相似度越高，可重复性越高。最后进行差异可视化处理，并且进行目的 RNA 靶基因功能富集分析，从而鉴定相关功能。

目前已经开发出了第三代 RNA-seq 技术，可以深度挖掘更为精细结构中的序列，用于开发基因芯片。比如分析发现 poly-A 尾巴中还存在其他碱基，对精细结构的分析具有重要意义。

参考文献：

1. Habib, N., et al. Disease-associated astrocytes in Alzheimer's disease and aging. Nature neuroscience 23, 701-706 (2020).

2.Matias, I., Morgado, J. & Gomes, F. Astrocyte heterogeneity: impact to brain aging and disease. Front. Aging Neurosci. 11, 59 (2019).

3. Rodríguez-Arellano, J., Parpura, V., Zorec, R. & Verkhratsky, A. Astrocytes in physiological aging and Alzheimer’s disease. Neuroscience 323,170–182 (2016).

4. Keren-Shaul, H. et al. A unique microglia type associated with restricting development of Alzheimer’s disease. Cell 169, 1276–1290.e17 (2017).