听说大家都准备做 m6A 了，你想好要怎么做了吗？
丁香园
继蛋白质翻译后修饰，RNA转录后修饰成为了又一个新的热点，今年国自然项目必然也是RNA转录后修饰的一个大年，且刚好又到了一年一度开题的季节，很多同学都摩拳擦掌，准备在RNA转录后修饰这个领域做番研究，但你想好要怎么做了吗？今天，小编就用一篇PNAS的文章讲解一下RNA转录后修饰的研究思路。
作为哺乳动物中最常见的mRNA转录后修饰的方式，N6-甲基腺嘌呤（N6-Methyladenosine, m6A）占所有腺嘌呤残基的0.1%-0.4%，通常发生在3’-UTR端起始处，影响了RNA的稳定性以及功能的执行，通常认为m6A可以促进RNA的降解。在RNA甲基化中共有三种参与者：
l Writers：甲基化执行者，METTL3、METTL14、WTAP；
l Erasers：去甲基化执行者，FTO、ALKBH5；
l Readers：m6A位点识别者，YTHDF 1-3
今天要介绍的文章是2016年发表于《PNAS》上的Hypoxia induces the breast cancer stem cell phenotype by HIF-dependent and ALKBH5-mediated m6A-demethylation of NANOG mRNA。由标题便可以初步判断这个研究课题的套路：
l 老瓶装新酒：缺氧微环境促进肿瘤细胞干性；
l 选择了m6A的去甲基化执行者ALKBH5作为研究对象
l 选择某一基因（NANOG）作为ALKBH5的靶标
研究背景有两个：①已有NANOG在METTL3的调控下发生甲基化的报道，且NANOG作为一个多能干性因子，可促进乳腺癌干细胞（BCSC）的产生；②HIF介导了缺氧微环境对ALKBH5的促进作用。在此基础上，这个文章做了哪些研究？四幅简图带你理清文章的思路和方法：
1. ALKBH5介导了缺氧对m6A RNA的抑制作用
（1） HIF介导了缺氧微环境对ALKBH5的调节：RT-qPCR、WB
（2） HIF介导了缺氧微环境对RNA m6A修饰的抑制：m6A免疫共沉淀，RT-qPCR；
（3） ALKBH5介导了（2）: m6A免疫共沉淀，RT-qPCR
2. ALKBH5介导了缺氧对NANOG mRNA的上调作用
（1） 缺氧上调NANOG表达：RT-qPCR，WB；
（2） ALKBH5介导了（1）: RT-qPCR，WB;
3. ALKBH5通过去甲基化，加强了 NANGO mRNA的稳定性
（1） ALKBH5介导了缺氧对NANOG的m6A修饰：m6A免疫共沉淀，RT-qPCR；
（2） NANOG的m6A修饰影响了mRNA的稳定性：Flavopiridol处理，RT-qPCR；
（3） NANOG的m6A修饰位点确认：点突变，荧光素酶报告基因
4. ALKBH5介导了缺氧对BCSC的促进作用
（1） ALKBH5介导了缺氧对乳腺癌细胞成球能力的促进作用：Mammosphere Assay；
（2） ALKBH5介导了缺氧对ALDH阳性乳腺癌细胞的促进作用：流式细胞学分析；
5. 过表达ALKBH5进行回复实验以及稳定干扰ALKBH5后进行体内实验
至此，整篇文章便结束了，由简图可以看出，铁打的缺氧和ALKBH5，流水的下游，每一个部分的逻辑大致均为“缺氧—现象”、“缺氧—ALKBH5—现象”，最后形成了这个逻辑链
这篇文章要解决的关键问题很简单，就是将ALKBH5与m6A NANOG构成因果关系，然后串联上下游形成完整逻辑链，使用的研究m6A的方法也十分简单，仅仅是一个m6A试剂盒联合RT-qPCR便可以直接分析基因的m6A水平，前体是已知这个基因的甲基化位点，剩下的就都是常规的实验技术了。
基因或微环境—m6A参与者—甲基化靶标—生物学功能，我们完全可以结合自己手上的课题，将已有的思路拓展为这个套路，分析RNA甲基化后的降解、转运、可变剪接以及翻译的变化，说不定会有意外的惊喜哦。
附：文中关键实验试剂盒
m6A RNA Methylation Quantification Kit（Epigentek EpiQuik）
MammoCult Medium Human Kit（Stem Cell Technologies）
备注：
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