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        如何拯救被污染的细胞?

        生物学霸

        15411

        细胞经常变成「脏脏胞」!养细胞的朋友在这方面困惑颇多,今天针对贴壁生长的细胞谈谈。


        在讨论之前,大家首先要有一个概念,即洁净区,并不是没有细菌,而是细菌的数量非常少,国家标准 100 级的洁净标准是浮游菌数不得超过 5 个每立方米,沉降菌数不得超过 1 个每培养皿,而国外的标准比我国的还要高一点,要求的数量更少。


        所以在我们的洁净操作台里,并不是真正一个细菌都没有的,所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。 所以处理细菌污染的重要原则就是:无限地稀释细菌的浓度,无限地减少细菌的数量!



        污染处理流程


        1.将污染的培养液倒掉,转烧瓶口,加入 10 mlPBS,适当晃动清洗培养瓶,然后倒掉。转烧瓶口。


        2.继续加入 10 mlPBS,同样方法晃动,清洗培养瓶,然后倒掉。


        3.继续加入 5 mlPBS,同样方法洗瓶,主要是培养面,然后倒掉。


        4.重复步骤 3 再洗。


        5.重复步骤 3 再洗。


        6.加入 3-5 ml 双抗,洗瓶,静置 3-5 分钟,然后吸出。


        7.加入 3 ml 双抗,洗瓶,静置 3-5 分钟,然后吸出。


        8.再加入 5 mlPBS 洗瓶,然后吸出。


        9.加入 10 ml 培养液,加入 2 ml 双抗,放置培养箱培养,5 小时之后,倒掉培养基,加入 PBS 洗瓶两次,然后加入胰酶消化,吹打后置于离心机 800-1000r/min 离心,然后洗一次。置于新的培养瓶里培养,培养体系加入 2 ml 双抗。


        10.24 h 之后,视情况换液,若仍然污染严重,培养基浑浊,重复以上步骤,若看不到污染物,则继续步骤 1)、3)、4)、6)、8),然后加入培养液培养,培养体系加入 2 ml 双抗。


        11.24 h 之后,若仍污染严重,可再重复一次,若还污染只能弃之(不过一般没有出现这种情况),若镜下不见污染物,则换液 PBS 洗瓶,正常培养。


        以上是对于细菌污染(常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌);若为霉菌或者真菌污染,加入两性霉素 B 清洗和培养,终浓度一般为 2.5 μg/ml(在 30 μg/ml 时会有细胞毒性)。另外也可以选择在培养基里加 3ug/ml 的制霉菌素或放线菌素 D。 其它操作同;


        若为支原体,用泰乐处理支原体污染效果比较好;若为黑胶虫污染,我基本上重新培养了,除此还是需要你在无菌观念和无菌操作上下大功夫加强了,黑胶虫在科研领域还是很未知的啊。所以没有什么好的应对方法。预防为主,还是要强调无菌操作,尤其注意血清的质量,这个是主要来源。一般建议用北美血清,这个黑胶虫污染会概率小。


        在操作的过程中,一定要小心操作动作,轻柔缓慢,切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。以上方法操作得当,基本上都能救活你的细胞(我还没有听到没救活的反馈)。当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的,我还是建议你把污染的扔掉,再复苏方便省事。这个拯救细胞还是主要针对你就只剩这一瓶细胞无路可退的时候。


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