病毒滴度测定方法总结

生物学霸2016-06-21

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自己做过不少实验，有些心得方法总结一下分享给大家。病毒滴度的测定常见方法有以下两种：

稀释计数法

滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

第一天细胞准备

将生长状态良好的 293 T 细胞消化计数后稀释至 1×100 000/mL，加入 96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备 10 个孔。放入 37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。

第二天加病毒

在 EP 管中做 10 倍梯度稀释，连续 10 个稀释度。稀释方法如下：每种病毒准备 10 个 1.5 mL EP 管，每管加入 90 μL 培养液，往第一个管中加入 10 μL 病毒原液，混匀后，吸取 10 μL 加入第二个管混匀。依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。

吸取 96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。并做好标记。

第三天追加培养液

在每个孔再加入 100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。

第五天观察结果并计算滴度

在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为 X 和 Y，则滴度（TU/mL）=（X+Y×10）×1000/2/X 孔的病毒液的含量（μL）。

定量 PCR 法

病毒感染 1 天前，取 6 孔板接种 HOS 细胞。每孔细胞为 5×100 000 个。

接种细胞 24 小时后，取两个孔的细胞用血球计数板计数，确定感染时细胞的实际数目，记为 N。

弃去其他培养板中的培养基，更换为含有 5 μg/mL polybrene 的新鲜培养基。将浓缩病毒用培养基稀释 200 倍，也就是取 1 μL 病毒加入到 199 μL 的培养基中。在 3 个培养孔中分别加入 0.5 μL，5 μL 和 50 μL 的稀释病毒。

感染开始后 20 小时，除去培养上清，换为 500 μL 含 DNaseI 的新鲜培养基。在 37℃ 消化 15 分钟，这一步是要除去残余的质粒 DNA。然后换为 2 mL 正常的培养基，继续培养 48 小时。

用 0.5 mL 0.25% 胰酶-EDTA 溶液消化细胞，在 37℃ 放置 1 分钟。用培养基吹洗下，离心收集细胞。按照 DNeasy 试剂盒的说明抽提基因组 DNA 。每个样品管中加入 200 μL 洗脱液洗下 DNA 。用 DNA 定量试剂盒定量（Bio-Rad）。基因组 DNA 可以稳定保存在 -20℃ 至少两个月。

准备 PCR 所需的试剂和样品。为病毒序列检测引物配总管 Ⅰ：

●Forward primer（100 pmol/mL）：0.1μL × n

●Reverse primer（100 pmol/mL）：0.1μL × n

●Probe（100 pmol/mL)：0.1μL × n

●水：19.7 μL × n

n = number of reactions。例如：总反应数为 40，将 1 mL 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，4 μL forward primer，4 μL reverse primer，4 μL probe 和 788 μL 水混和。震荡后放在冰上。

●2× TaqMan Master Mix：25 μL × n

●10×RNaseP primer/probe mix：2.5 μL × n

●水：17.5 μL × n

n = number of reactions。例如：总反应数为 40，将 1 mL 2× TaqMan Universal PCR Master Mix，100 μL 10×RNaseP primer/probe mix 和 700 μL 水混和。震荡后放在冰上。

在预冷的 96 孔 PCR 板上完成 PCR 体系建立。从总管 Ⅰ 中各取 45 μL 加入到 A-D 各行的孔中，从总管 Ⅱ 中各取 45 μL 加入到 E-G 各行的孔中。

分别取 5 μL 质粒标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 A-D 行中，每个样品重复 1 次。另留 1 个孔加入 5 μL 的水做为无模板对照（no-template control）。

分别取 5 μL 基因组标准品和待测样品基因组 DNA 加入到 E-G 行中，每个样品重复 1 次。另留 1 个孔加入 5 μL 的水做为无模板对照（no-template control）。

所使用定量 PCR 仪为 ABI PRISM 7000 定量系统。循环条件设定为：50℃ 2 分钟，95℃ 10 分钟，然后是 95℃ 15 秒，60℃ 1 分钟的 40 个循环。

数据分析：测得的 DNA 样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定，得到每基因组整合的病毒拷贝数。

滴度（integration units per mL，IU/mL）的计算公式如下：

IU/mL= (C ×N× D×1000)/V

其中：C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数；N = 感染时细胞的数目（约为 1×100000）D = 病毒载体的稀释倍数；V = 加入的稀释病毒的体积数。