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        CRISPR/Cas9 基因敲除实验全记录 -- 构建 sgRNA+Cas9 载体

        春卷00

        8527

        前期记录

        先确定目标基因

        CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 确定目标基因

        然后对目的基因进行背景调查

        CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- 目的基因背景调查

        设计 sgRNA 及引物

        CRISPR/Cas9 基因敲除实验 -- sgRNA 及引物设计

        补充

        上次推文我针对 sgRNA 设计方面增加了一部分内容,有一位特别棒的读者(简书名:chuxinxzz)在下方留言说可以使用 Cas9 +sgRNA 切割效率试剂盒验证切割效率,并且经实践得知,验证结果和实际编辑结果相差无几。感谢他给我的补充,这也是我写下去的动力,毕竟我一个人的精力是有限的,因此不论我好与坏,我都先把自己拎出来,以期待得到其他人的交流和答复,从而学到更多的经验。

        昨天和今天

        昨天我依照 golden gate assembly 的方法,参照了张峰老师实验室 protocol,使用了 BbsI 限制性内切酶和 T4 连接酶,将合成好的 sgRNA 插入到带有 Cas9 的质粒中;接着转化到感受态细胞中--复苏感受态细胞后--涂氨苄西林平板过夜培养--今天傍晚挑取单克隆菌落置于氨苄西林+LB 培养基中过夜培养,明日即可提取质粒并酶切验证。但由于 293FT 细胞冻存于液氮罐中,今日打台风没有来得及复苏该细胞,因此转染实验有拖后。

        下一步

        质粒小提试剂盒

        酶切实验使用到的相关限制性内切酶(BbsI)

        准备好 293FT 细胞(应提前准备,一旦酶切验证成功,立即转染筛选),也就是在这一步,可以使用上文提到的读者建议用的酶切效率试剂盒。如此看来,可以节约下至少 4 - 6 天的时间,当真是好办法的。

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