越发火热的 CRISPR Screen 技术又发大文章，耶鲁大学 Cell 揭示在 CD8 T 细胞中筛选出免疫治疗新靶点！

2019 年 8 月 22 日，耶鲁大学教授 Sidi Chen 课题组在 Cell 杂志发表文章《Systematic Immunotherapy Target Discovery Using Genome-Scale In Vivo CRISPR Screens in CD8 T Cells》在肿瘤免疫治疗环境下对 CD8 T 细胞进行了基因组规模的 CRISPR 筛选[1]。

在重新确定了典型的免疫治疗靶点，如细胞程序性死亡蛋白 PD- 1 和 T 淋巴细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构分子 TIM- 3 的同时，也筛选出了 Dhx37 等一批尚未在 T 细胞中鉴定过的基因。

图片来源：Cell[1]

研究人员发现，核糖核酸 RNA 解旋酶 DHX37 可以对 CD8 受体阳性 T 淋巴细胞浸润肿瘤并分泌细胞毒性颗粒进行调控。在体内敲除 Dhx37 基因后增强了抗原特异性 CD8 T 细胞对三阴性乳腺癌的疗效。

同时，小鼠和人类 CD8 T 细胞的免疫学特征表明，DHX37 具有抑制效应因子功能、细胞因子的产生和 T 淋巴细胞的活化的作用。生化实验和转录组分析显示，DHX37 与核因子 kB (NF-kB) p65 和 PDCD11 相互作用，共同调节 CD8 T 细胞的 NF-kB 通路活性

该研究结果表明，在体内进行高通量的基因筛选可以用于探索免疫治疗靶点，并确定 DHX37 可调节 CD8 受体阳性 T 淋巴细胞功能，作为三阴性乳腺癌免疫治疗靶点。

作为一种强大的基因编辑工具，近年来随着 CRISPR/Cas9 技术的发展，其被广泛地应用于基因敲除、敲入，转录激活、抑制，DNA 甲基化，组蛋白修饰以及全基因组筛选等领域[2]。

Cas9 蛋白功能的多样性[2]

图片来源：Nat Rev Genet

其中应用于全基因组的筛选，即 CRISPR Screen 技术，在筛选免疫治疗靶点、药物研发等领域展现出高效且精准的效果[3]。

利用 CRISPR Screen 技术进行高通量筛选时可以产生大量的基因突变细胞，在不同的外界环境刺激下对突变的细胞文库进行筛选，通过高通量测序和生物信息学分析，便可进一步确定表型与基因型的关系。

并且，基于 CRISPR/Cas9 文库的高通量筛选也克服了利用 RNA 干扰筛选技术所面临的转染效率低且仅能从 mRNA 水平上抑制基因表达等问题。使其在精准医疗时代具有巨大科研价值和广阔的应用空间。

CRISPR Screen 在高通量基因编辑中的应用

图片来源：GENEWIZ

在癌症治疗研究领域

CRISPR Screen 也被用于诸多功能基因的筛选。其中，体内 CRISPR 筛选已成为一种功能强大且灵活的工具。

目前，全基因组 CRISPR 筛选技术已极大地促进了包括肿瘤转移、恶性转化、免疫逃逸和耐药性的调控等方面的研究工作，将来也可能对诸如血管生成、基因组不稳定性等领域的研究起到助推作用[3]。

体内 CRISPR Screen 技术在功能性癌症基因组学中的应用[3]

图片来源：Trends Cancer

上海市肿瘤研究所的覃文新研究员团队利用 CRISPR Screen 技术，通过高通量功能基因组学筛查揭示了 CDK7 可以作为肝癌的潜在治疗靶点 [4]。

生物信息学分析显示 CDK7 在肝癌组织中显著高表达。使用 CDK7 抑制剂 THZ1 处理肝癌细胞株后，部分肝癌细胞株 CDK7 抑制剂非常敏感，部分细胞株则不敏感。为肝癌防治提供了新思路。

在病毒与宿主互作研究领域

基于 CRISPR Screen 技术的宿主全基因组 sgRNA 文库高通量筛选平台，可快速发现参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主因子[5]。

通过明确病毒-宿主分子相互作用进而揭示病毒的生命周期，可为病毒与宿主相互作用的研究提供十分强大的研究工具。

基于 CRISPR/Cas9 技术的病毒复制相关宿主因子筛选示意图[5]

图片来源：微生物学报

2018 年 5 月美国圣路易斯华盛顿大学医学院的 Diamond 教授在 Nature 发表文章，利用 CRISPR Screen 技术进行全基因组水平筛选，鉴定并证明了基质重塑相关蛋白 8（Matrix Remodeling Associated 8, MXRA 8）是致关节炎类甲病毒，如基孔肯雅病毒的一种哺乳细胞侵入受体 [6]。

并且在后续的研究工作中，该团队与中国科学院微生物研究所高福院士团队与中科院天津工业生物技术研究所高峰研究团队在 Cell 杂志以背靠背的形式发表文章，分别揭示了该蛋白的电镜与晶体结构，从分子水平阐释了基孔肯雅病毒囊膜表面 E 蛋白与其细胞受体基质重塑相关蛋白 8（MXRA 8）分子相互作用的机制，揭示了此类病毒入侵细胞的分子机制。

随后该团队又通过构建 Mxra8 缺失的小鼠以及 Mxra8 转基因果蝇，从基因缺失与基因敲入两个方面在体内证明了细胞受体 Mxra8 能促进病毒的致病性 [7, 8]。

MXRA 8 分子结构及在体内促进病毒的致病性示意图

图片来源：Cell

综上所述，近年来随着 CRISPR/Cas 技术的发展，以 CRISPR/Cas9 系统为基础的 CRISPR Screen 技术，在对多个基因或全基因组的基因功能进行同时研究的工作上取得诸多进展。

目前 CRISPR Screen 发表的文章主要有算法开发、数据分析及技术应用几方面。从 2014 年第一篇 CRISPR Screen 文章到目前 2019 年 9 月止，相关文献已达 1 千余篇，其中许多发表在 CNS 等顶级期刊上面。

因此，利用 CRISPR Screen 技术对多基因功能筛查，同时结合基因组学、疾病表型和治疗靶点等方面的研究，从而实现个性化和精准医疗的目标是十分具有广阔前景的！

参考文献：

[1] M.B. Dong, G. Wang, R.D. Chow, L. Ye, L. Zhu, X. Dai, J.J. Park, H.R. Kim, Y. Errami, C.D. Guzman, X. Zhou, K.Y. Chen, P.A. Renauer, Y. Du, J. Shen, S.Z. Lam, J.J. Zhou, D.R. Lannin, R.S. Herbst, S. Chen, Systematic Immunotherapy Target Discovery Using Genome-Scale In Vivo CRISPR Screens in CD8 T Cells, Cell 178(5) (2019) 1189 - 1204 e23.

[2] J.G. Doench, Am I ready for CRISPR? A user's guide to genetic screens, Nat Rev Genet 19(2) (2018) 67 - 80.

[3] R.D. Chow, S. Chen, Cancer CRISPR Screens In Vivo, Trends Cancer 4(5) (2018) 349 - 358.

[4] C. Wang, H. Jin, D. Gao, L. Wang, B. Evers, Z. Xue, G. Jin, C. Lieftink, R.L. Beijersbergen, W. Qin, R. Bernards, A CRISPR screen identifies CDK7 as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma, Cell Research 28(6) (2018) 690 - 692.

[5] 王文静, 李素, 肖书奇, 等. 基于 CRISPR/Cas9 技术的高通量筛选平台: 发掘病毒复制相关宿主分子的新途径 [J]. 微生物学报, 2018, 58(11): 1897 - 1907.

[6] R. Zhang, A.S. Kim, J.M. Fox, S. Nair, K. Basore, W.B. Klimstra, R. Rimkunas, R.H. Fong, H. Lin, S. Poddar, J.E. Crowe, Jr., B.J. Doranz, D.H. Fremont, M.S. Diamond, Mxra8 is a receptor for multiple arthritogenic alphaviruses, Nature 557(7706) (2018) 570 - 574.

[7] R. Zhang, J.T. Earnest, A.S. Kim, E.S. Winkler, P. Desai, L.J. Adams, G. Hu, C. Bullock, B. Gold, S. Cherry, M.S. Diamond, Expression of the Mxra8 Receptor Promotes Alphavirus Infection and Pathogenesis in Mice and Drosophila, Cell Rep 28(10) (2019) 2647 - 2658 e5.

[8] H. Song, Z. Zhao, Y. Chai, X. Jin, C. Li, F. Yuan, S. Liu, Z. Gao, H. Wang, J. Song, L. Vazquez, Y. Zhang, S. Tan, C.M. Morel, J. Yan, Y. Shi, J. Qi, F. Gao, G.F. Gao, Molecular Basis of Arthritogenic Alphavirus Receptor MXRA8 Binding to Chikungunya Virus Envelope Protein, Cell 177(7) (2019) 1714 - 1724.e12.