断肠草发挥「护心丸」的作用，温医梁广团队揭示雷公藤红素诱导的心脏重构分子机制
雷公藤是常用主要中药材，本草书籍中有断肠草、莽草之称。中医认为，雷公藤是大毒之药，民间有「七步断肠」的传说。《周礼》中有用莽草熏杀蠹虫的记载。在现代医学中，雷公藤最重要的活性成分之一，雷公藤红素被广泛用于治疗慢性炎症和免疫紊乱等多种适应症中。
2007 年，雷公藤红素、青蒿素、雷公藤甲素、辣椒素和姜黄素被 Cell 杂志列为最有可能，也最值得开发为现代药物的五种天然化合物 [1]。虽然高剂量的雷公藤红素具有一定的心脏毒性，但低剂量的雷公藤红素却被发现可以保护心血管，其确切的疗效和机制引起了众多科学家的关注。
2020 年 2 月 26 日，来自中国温州医科大学第一附属医院的梁广课题组，在国际心血管领域权威杂志 Circulation Research（IF=15.9）上发表了题为 Celastrol Attenuates Angiotensin II-induced Cardiac Remodeling by Targeting STAT3 的研究性论文 [2]，首次揭示天然产物雷公藤红素通过直接与 STAT3 蛋白结合，降低其酪氨酸磷酸化和核易位，对 Ang II 介导的有害心脏重构具有保护作用。
图片来源：Circulation Research
背景介绍
高血压是引起心室重构和心脏衰竭的重要因素。2018 年，我国成年高血压患者的数量高达 2.45 亿之多，高血压可使心衰发生的风险增加 2-3 倍，我国高血压患者伴心衰比率可达 54.6%。目前研究认为，以心室充盈异常为特征的舒张功能障碍是高血压和心力衰竭之间早期和重要的病理生理过程。
已经发现肾素 - 血管紧张素 - 醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）在多种心血管疾病中发挥作用。在高血压心脏病中，循环中血管紧张素 II（angiotensin II，Ang II）水平增加，可诱导心肌细胞炎症反应，并导致细胞肥大和基质蛋白沉积增加，最终导致心脏舒张功能障碍。雷公藤红素在 Ang II 诱导的心脏重塑中发挥的作用仍然未知。
主要内容
首先，研究者发现了雷公藤红素减少 Ang II 诱导的心肌肥大和纤维化的现象。在给予大鼠原代心肌细胞和 H9C2 细胞 Ang II 处理后，心肌肥大标志物 β-MyHC 水平升高，且持续 36h。基于雷公藤红素在 24 小时时间点的细胞活力测定结果，研究者选择 0.25nM、0.5nM 和 1nM 雷公藤红素浓度来评估其在心肌细胞中的作用。
在原代心肌细胞和 H9C2 细胞中，Ang II 显著提高了心肌肥大标志物 β-MyHC、心肌纤维化的标志物 Collagen I、TGF-β1 的表达水平。雷公藤红素预处理后，剂量依赖性地抑制了 Ang II 诱导的这些基因的表达。罗丹明鬼笔环肽染色显示雷公藤红素显著减少了 Ang II 诱导的细胞面积增加。这些结果表明雷公藤红素降低了 Ang II 诱导的心肌细胞基质蛋白的表达和肥大。
图片来源：Circulation Research
接下来，确定 STAT3 是雷公藤红素的一个直接结合蛋白。研究者为了确定雷公藤红素保护 Ang II 诱导的心肌细胞肥大和纤维化的分子机制，研究者对可能的雷公藤红素结合蛋白进行了筛选。
使用了带有生物素标签的雷公藤红素（Bio-Celastrol），检测其与 HuProtTM 人蛋白微阵列上的重组蛋白的结合情况，利用 STRING 软件进行聚类分析，使用 Cy3 缀合的链酶亲和素 (Cy3-SA) 检测。
结果显示雷公藤红素能较好地结合过氧化物酶蛋白、含有 VHS (Vps27-Hrs- STAM) 结构域的蛋白、STAT 蛋白。在排除了前两种蛋白后，STAT3 引起了研究者的兴趣。研究者发现雷公藤红素与重组人 STAT3 (rhSTAT3) 蛋白相互作用，并通过 ELISA 系统被进一步证明。
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随后，进一步研究了雷公藤红素与 STAT3 蛋白的结合模式。研究者进行了体外细胞实验，通过生物素化的蛋白相互作用下拉试验，进一步确定了雷公藤红素与 H9C2 细胞和小鼠心脏组织的裂解物中的 STAT3 蛋白结合。
由于 SH2 结构域和 CCD 结构域是设计或筛选 STAT3 抑制剂的两个广泛研究的结构域，为了解雷公藤红素在 STAT3 蛋白的可能相互作用位置，研究者利用 STAT3 的晶体结构进行了分子嵌合和模拟研究，缩小了 SH2 和 CCD 域上可能与雷公藤红素结合的氨基酸位点。随后构建位点突变质粒，转染 293A 细胞，下拉实验结果表明，CCD 域的 Leu-207 和 SH2 域的 Gln-635/Val-637 参与了雷公藤红素 - STAT3 的相互作用。
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再下来， 既然雷公藤红素与 STAT3 结合，那么雷公藤红素是否能够抑制 Ang II 诱导的 STAT3 激活，并通过靶向 STAT3 阻止心肌细胞重塑？
Ang II 处理原代心肌细胞 1 小时，STAT3 Tyr 705 磷酸化水平升高，12h 时达到最高水平，雷公藤红素可以阻断其磷酸化水平。由于 STAT3 介导的基因调控主要是通过 STAT3 的核易位实现的，所以研究者又发现雷公藤红素减少 Ang II 介导的 STAT3 核转位。由于雷公藤红素 - STAT3 相互作用不需要 Tyr 705 磷酸化，所以雷公藤红素也可能调节 STAT3 的核定位，而不依赖于其磷酸化。
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之后在原代心肌细胞中，敲低 STAT3 抑制 Ang II 诱导的肥大和促纤维化标记物的表达，这种抑制 Tyr 705 磷酸化的减少的有关。相反地，单独过表达 STAT3 并不会增加 H9C2 细胞中 β-MyHC 和 TGF-β1 水平，但会产生更高水平的 STAT3 磷酸化蛋白。在 STAT3 磷酸化饱和状态下，雷公藤红素不能降低过表达 STAT3 细胞中的 β-MyHC 和 TGF-β1 以及 STAT3 磷酸化水平。总之，这些结果表明雷公藤红素参与 STAT3 抑制 Ang II 诱导的心肌细胞重塑。
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最后，在体研究了雷公藤红素是否抑制 Ang II 诱导的 STAT3 激活和小鼠心脏重构。研究者构建了两种小鼠模型，一种是皮下埋泵 Ang II 小鼠模型，同时给予雷公藤红素治疗；另一种是 Ang II 埋泵两周后，给予雷公藤红素治疗。超声检测心功能，心脏组织化学染色检测结构变化。结果表明雷公藤红素可以抑制小鼠心脏 STAT3 的激活，防止 Ang II 诱导的心脏重构，且雷公藤红素可以逆转 Ang II 诱导的心肌细胞重塑。研究者在 TAC 诱导的高血压性心室重构的小鼠模型进行了同样的实验，得到了同样的结果。
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研究意义
本研究首次揭示并深入阐明天然产物雷公藤红素防治高血压心脏病的作用、机制和靶点，雷公藤红素通过直接与 STAT3 蛋白结合对 Ang II 介导的有害心脏重构具有保护作用。在小鼠中，雷公藤红素在 Ang II 诱导和 TAC 诱导的小鼠模型中均可预防心脏功能缺陷，减少心脏纤维化和肥厚。
问题探讨
1，STAT3 在不同的心脏病中发挥不同的作用。之前研究发现 STAT3 的激活可介导心肌缺血 / 再灌注损伤的保护作用。那么，本研究中发现的 STAT3 激活导致心功能障碍是否仅限于 Ang II 刺激。未来的研究有必要利用一种在特定压力下诱导的心肌细胞特异性 STAT3 基因敲除，以排除发育影响，确认 STAT3 在心脏病理学中的作用。
2，本研究中 Ang II 处理之前或之后添加雷公藤红素均可有效降低 STAT3 磷酸化水平，且都抑制了肥大和纤维化基因的表达。那么雷公藤红素对 STAT3 磷酸化和核易位的抑制是否通过不同的机制介导。
3，目前，临床使用雷公藤红素存在的主要问题是治疗窗口狭窄，以及潜在的副作用。虽然研究者在小鼠身上使用了 0.5 和 1 mg/kg 的低剂量，但最近报道当剂量达到 3 或 4mg/kg 时可能会产生副作用。因此，雷公藤红素可能不能立即用于高血压相关的心脏重构、癌症或其他炎症的单一治疗，但就目前获得结果值得进一步研究。
