DNA重组

我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对 ...

将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种： 1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷 ...

将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种： 1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷 ...

方法一 A液：1M，MnCl2： B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌； C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。 取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A ...

方法一 A液：1M，MnCl2： B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌； C液 称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。 取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A ...

Prepare:200ml LB in a 1L flask1L sterile ddH2O and place in cold room4 50ml conicals chilled on ice10% glycerol (cold)Chilled boxes of 100ul and 1ml pipet tips.Chilled 0.5ml tubes.GeneralThis protoco ...

1. Run the gel as normal. Often for genomic southerns it is desirable to run long gels (18cm) over 4-6hrs.2. Photograph the gel with a ruler adjacent to the molecular weight markers as a reference.3. ...

1. Run the gel as normal. Often for genomic southerns it is desirable to run long gels (18cm) over 4-6hrs.2. Photograph the gel with a ruler adjacent to the molecular weight markers as a reference.3. ...

用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。（一） 器材：台式 ...

用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。（一） 器材：台式 ...

Materials:Whatman 3 mm Blotting Papernitrocellulose (Schleicher & Schuell Amersham) or nylon membrane filter (Amersham).Paper towels (preferably C-fold "cheap-o" variety)Pyrex or Tupperware dish glass ...

Digest DNA in 96-well plateTo each well add:4ul 10Xbuffer4ul Enzyme0.4ul Spermidine(0.4M)31.6ul H2O37‡C 19h then add 4ul loading dye to each well. Load into 400ml 1% agarose gel immediately or keep th ...

克隆成功与否除与连接方式以及载体选择有关外，载体的处理也是一个重要环节。为了提高连接效率，处理载体时应注意以下几点：� (1)应加入常用量5～10倍的内切酶水解载体，以保证载体被完全酶切；� (2)如用双酶切割载体，则必须电泳回收载体片段，除去双酶切所产生的小DNA片段；�(3)如粘端连接单酶切处理过的载体必须用 碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。CIP可 ...

克隆成功与否除与连接方式以及载体选择有关外，载体的处理也是一个重要环节。为了提高连接效率，处理载体时应注意以下几点：� (1)应加入常用量5～10倍的内切酶水解载体，以保证载体被完全酶切；� (2)如用双酶切割载体，则必须电泳回收载体片段，除去双酶切所产生的小DNA片段；�(3)如粘端连接单酶切处理过的载体必须用 碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。CIP可 ...

一. 实验目的1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。二. 实验原理1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不 ...

1. Separate DNA fragments in an agarose gel cast with 0.5 mg/mL Ethidium bromide. Locate bands with a hand-held long-wave UV lamp.2. Slice the gel with a razor blade above and below the bands of inter ...

1. Separate DNA fragments in an agarose gel cast with 0.5 mg/mL Ethidium bromide. Locate bands with a hand-held long-wave UV lamp.2. Slice the gel with a razor blade above and below the bands of inter ...

一. 实验目的1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基本操作过程2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长度，并能对实验结果进行分析。二. 实验原理1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不 ...

Day 11. Digest DNA for 6 hours (or overnight)BSA 10 mg/ml 0.5 22.65 ul of 10 ug Genomic DNARnaseA 10mg/ml 0.1 in TE mixed to 7.35 ul cocktailSpermidine 100nM 0.75 per sample10X enzyme buffer 3.0enzyme ...

Southern Blot Flow一 基因组酶切和电泳在200 μl 微量离心管中加入：25 μl DNA样品(约10μg)，3μl 限制性内切酶（MBI，10 U/ μl）5 μl 相应的10×buffer，补水到50μl。然后加一滴矿物油覆盖 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后，取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切充分，灌制0.8%的agro ...