克隆中载体的处理和去磷酸化
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克隆成功与否,除与连接方式以及载体选择有关外， 载体的处理也是一个重要环节。为了提高连接效率，处理载体时应注意以下几点：
（1）应加入常用量5～10倍的内切酶水解载体，以保证载体被完全酶切；
（2）如用双酶切割载体，则必须电泳回收载体片段，除去双酶切所产生的小DNA片段；
（3）如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。
（3）如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。
CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。对于3末端突出的DNA(如【ＷＴ５ＢＸ】Pst【ＷＴ５ＢＺ】I水解，需用10倍于5末端突出DNA(如【ＷＴ５ＢＸ】Eco【ＷＴ５ＢＺ】RI,【ＷＴ５ＢＸ】Hin【ＷＴ５ＢＺ】dⅢ)的CIP进行去磷酸化，以达到最少的载体自身环化。
去磷酸方法如下：
①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液，5端突出的DNA，每100 pmol 5磷酸基团加入1个单位的CIP，37 ℃反应30分钟。平末端或3端突出的DNA，每2 pmol 5磷酸基团加1个单位CIP，37 ℃保温15分钟后，再加CIP，55 ℃反应45分钟(2 μg 5 kb的线性DNA约含14 pmol左右的5磷酸基团)；
②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分别至终浓度0.5%、 5 mmol/L和50 μg/ml，混匀后56 ℃反应30分钟；或加EDTA(pH8.0)至终浓度为5 mmol/L，65 ℃保温1小时或75 ℃，10分钟灭活CIP;
③冷却至室温后，加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次;
④乙醇沉淀，离心，抽干，溶于无菌去离子水，浓度最好为100 μg/ml,-20 ℃保存备用。【ＨＴ５Ｈ】10倍CIP去磷酸化缓冲液：【ＨＴ】【JZ(Z】10 mmol/L ZnCl2 10 mmol/L MgCl2 100 mmol/L Tris-HCl,pH8.0。
