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qdshlyykqk：我是新手，正在进行肿瘤细胞的GFP转染，有些问题想请教大家。因为在网上看到大家众说纷纭，一时拿不定主意。 1、利用转染之前的细胞进行G418筛选来确定最佳筛选浓度，是以1周还是2周完全杀死细胞为标准？有人说以1周的浓度作为将来转染之后的快速筛选阳性细胞的浓度，在对照组的为转染细胞大部分或全部死亡之后，以上述2周时的浓度作为维持浓度。有人说维持浓度应该是筛选浓度的1/2。究竟有 ...

yangbinxia：有没有人用脂质体转染过COS-7细胞呀？我看invergen lipofectamin 2000说明书上说这个细胞系转染效率99%，但我用GFP转染后40小时荧光显微镜下观察转染效率没有那么高仅有30－40%吧。可能我的转染条件不太好，我用的转染体系是1μg质粒加2μl脂质体/孔（24孔板）转染前一小时换无血清DMEM，转染后4小时换上10%FBS 的培养基。阳性 ...

cai_xiehe：各位战友，帮我看一下我们的培养的第二代SD大鼠骨髓间充质干细胞形态如何，能否拿去做流式细胞鉴定和慢病毒载体转染实验，万分感谢！ 再发一张也是第二代SD大鼠骨髓间充质干细胞图片 丁香园网友huli317认为： 想问问你这细胞是传代后多久的？ 这细胞形态真的太差了，特别是第二代就这种形态，你接下来的实验怎么完成啊 用作流式检测以及病毒感染都要细胞状态非常好，你要做流式怎么也得4到 ...

bixin1220：这几天做western条带出现了奇怪的现象。 band变成空心了，还有actin条带像PCR一样拉长了，请各位能人帮忙，指点谜径。 这是actin，我这是用细胞，分细胞质里的蛋白和细胞核里的蛋白做了western blot。细胞质里的蛋白actin就变成这样了，细胞核里的actin就正常。是不是我分得不对了就出现这种情况？我用RIPA buffer 提取蛋白的。 这是核 ...

summerray：请教如题，在脾细胞与瘤细胞融合时的一些问题 1 半分钟内加入PEG后静止一分钟前需不需要稍微吹匀呢，此时有不均匀细胞团块。 2 加入不完全培养液中止聚合后，需不需要先吹匀再离心呢，此时细胞团块在底部。 3 如何避免每个孔内是单个克隆呢，往往有好几个。 4 有限稀释法克隆化时有没有不计数的方法呢，肯定是有（很久以前一个老师那样做过，很难联系），如何操作呢。 多谢！ 丁香园网友yu ...

ziputao：真核表达载体转染细胞后必须要筛选吗？如G418，不筛，直接做指标检测行吗，谢大侠指教！ 丁香园网友yangea认为： 不一定，这是瞬时转染与稳定转染的区别。只要对所转入的基因能“可视”，达到检测的目的即可（如构建的载体连接有报告基因的情况）。按照转入目的基因的不同，瞬时转染可在12-72小时有表达，根据表达的峰值时间检测指标就可以了。 ...

ouyangty247：战友们有没有人正在做MMP-2和MMP-9的RT-PCR的？ 我正在做，做得头都大了还没做出来，还请多多交流！ 丁香园网友clearair00认为： 有什么问题能说的具体一些吗？大家帮你一起讨论，顺便也可以让后做类似实验的园友们少走些弯路，一举多得，岂不快哉！ 丁香园网友ouyangty247认为： 我是从文献上直接查的引物，cDNA合成的GAPDH能出来，条带还挺宽挺亮， ...

ouyangty247：我正在做rt-pcr，奇怪的是，我用的同一支RNA，同时逆转录好几管，所有的东西都是预混好再分装的。 PCR时，除cDNA外所有的东西也都是预混好再分装的，引物用的是GAPDH，再分别加入先前RT得到的cDNA，按理说不应该都是一样的么？可是跑胶后却发现有的有条带，有的就没有。做了好几次都是这样，为什么？？？太奇怪了！ 我做的头都大了，不知道到底是哪出了问题，恳请大家多多帮 ...

baichangming：核型分析图片处理问题 在核型分析中照出来的图片上，染色体地分布都是杂乱无章的，但是发表在刊物上的图片有的有排列的很好，这是怎么弄得呢？（如下图） 丁香园网友xudangood认为： 给核型排除，“整型”是要用到专业的核型分析软件的，比如ISIS　5.0等，在版内搜下应该有介绍。很多医学和大学也会提供这样的服务。 如果是想自己弄，不严格作为投稿的 ...

xuewanmei：用作基因芯片检测的细胞用什么试剂保存？ 我现在要分选细胞，送到公司里去做基因芯片检测，请问这些细胞应该用什么保存？ 我打算分选出来的细胞先放-80℃，等到分选出足够的量时再送到公司里去做检测！ 丁香园网友clearair00认为： 是做cDNA芯片吗？如果这样，最好是保存于RNA提取试剂如TRIZoL中后短期内（1month）置-80℃。 ...

amenrenren：为什么筛选了半个月后荧光变得很弱呢? 转染pEGFP-目的基因后36小时候加G418一天就死了百分之78十所以从第二天起就把浓度减半了，又筛了将近十天了，发现留下的基本有荧光，但都比较弱。我分析是G418浓度太低了所致，以至于只要表达甚少就可以生存了。 所以我打算在加大浓度一下大家认为是什么原因呢？ 帮我出出注意，荧光太弱到后面会不会就没了，太担心了 丁香园网友caprico ...

jw52317：细胞转染后的筛选，如何配制培养液？ 最近打算将一cDNA转染到一肿瘤细胞内，所用的质粒（pCMV）只有氨苄西林的抗性基因（Amp），请问有哪位朋友知道我转染细胞后该怎么配制筛选培养液，包括选用的抗生素，浓度已经转染后什么时候开始筛选的等。 丁香园网友学山肥虎认为： 1 质粒的概念 质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在 ...

tjmedwnn：确定G418最佳筛选浓度用什么细胞？ 大家好，我现在做实验，用G418抗性的逆转录病毒包装系统收获病毒液做稳定转染，第一步需要用PT67细胞包装收获病毒液，说明书上说质粒转入PT67细胞后要用G418做筛选，之前需要用不同浓度的G418做一个最佳筛选浓度试验。请教大家，用来做确定最佳浓度试验的PT67细胞是用未经过任何处理的PT67细胞呢还是用已经转染过的PT67细胞？？ 另外收 ...

kissdana：我用pEGFPC3真核表达载体用lipofectamine2000来转染3T3L1细胞，结果转染率特别低，请问那位同仁用过类似的方法转染过这个细胞？能否给些建议？多谢了 丁香园网友yushulin认为： 这个细胞转染的效率是很低，没太多好办法，试着换一下实际，我们用罗氏的HD转染效率比lipofectamine2000高一点，但是也不是很高。 ...

tjmedwnn：关于G418筛选的问题 大家好，请问我用G418筛选转染细胞，首先做最佳浓度确定实验，为什么要取5天杀死大量细胞，14天杀死全部细胞的最小量，我的问题是，为什么取5天，而不是3天或4天2天的，WHY？ 做最佳浓度确定实验加药时的细胞数有规定吗，是不是种多种少没什么区别？我感觉书上说的接种数量是不是太少了？细胞数目多对筛选有影响吗？ 丁香园网友DXY721认为： 细胞加了G418后 ...

tjmedwnn：请问25uM的氯喹是这样配的吗？？？？ 大家好，我做质粒转染，说明书上说转染前要加25uM的氯喹。我买的氯喹分子量是515.86，请问大家如果换算成质量这怎么计算啊，是不是25/515.86=0.048μg然后称取0.048μg加进去啊，请大家多教教我，谢谢！ 丁香园网友szcsyan认为： 一般配成stock，浓度高一点。比如25mM。用的时候再稀释。 看你买的是多 ...

feiniao2005038：测序本人拿菌液让生工测序，结果是双峰，是什么意思？怎么回事？重组的质粒用酶切鉴定没有问题， 丁香园网友zhaochengling认为： 1.有可能是基因重复，重复的两个拷贝之间有一个硷基的差异 样品本身被污染，这常常发生在样品为质粒和菌液的情况中。当使用通用引物测序时，如果刚好和样品中的几个质粒均能结合，那么就会出现这种情况，而且在同一位置上还可能有不止两个峰形； 2 ...

jc_484190：咨询3β-HSD的染色配方 请问有谁做过3β-HSD的染色啊？这种染色的配方是什么啊？南京的同学有没有在做得啊？ 丁香园网友jfeiharry认为： 刚刚baidu了一下，看了一点相关资料，希望对你有些帮助 3β-HSDH反应溶液 脱氢表雄酮（DHEA）10mmol溶于丙酮0.5ml 尼克酰胺（1.6mg/ml）1.0ml 硝基蓝四唑（NBT）（1 ...

flybaker：请教有关胰腺石蜡切片制作方法的问题 按照普通石蜡切片的制作流程做出的大鼠胰腺组织切片，能被染上的细胞很少，而且细胞间的空隙很大。我自己分析可能是由于胰腺厚薄不均，导致透明时间没掌握好，透明过度组织变脆。再加上胰腺形状不规则，切片时没切到整个面。不知道有没有人做过胰腺的石蜡切片，和普通组织的石蜡切片制作方法相比有没有什么需要特别注意的？？ 丁香园网友zgxsea认为： 是正常的大鼠 ...

phoolishkate：脂质体转染后必须用不含抗生素的培养基吗？ 我的培养基都加了青链霉素，转染后是不是不能用？ 丁香园网友applezph认为： 由于脂质体转染对细胞存在一定毒性，一般说来转染前的一次传代就应用不含抗生素的培养基，转染后的话我觉得也不应该加青链（我都是这么做的） 当然如果对自己的操作实在没有把握的话，我认为你可以考虑试试转染后加，但不要太早，4-6小时换液用无抗生素的，可以24 ...