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近几年来，随着分子生物学、遗传学及其新技术的迅速发展，真核生物基因表达(geexprc~ioB)的问题已有了突破性的进展。认为真核细胞基因的表达，受到多层次的调控，诸如转录，转录后，翻译、翻译后等水平。而不同基因的表达受到不同水平的调控，其中最为主要的就是转录水平的调控。 转录水平的调控涉及到顺式作用元件(cls acting elemeat)、反式作用因子(t rans acting facto ...

1、真核基因组的复杂性 与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。 （1）真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。 （2）真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。 ...

1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成， 在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克 ...

本篇中主要介绍生化方法及物理方法（电穿孔法） 一、生化方法 1、磷酸钙介导的质粒DNA转染真核细胞 （1）转染前24 h，通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以1×105至4×105细胞/cm2的密度平铺细胞于60 mm组织培养皿或12孔板上。于含5%～7% CO2的37℃温箱孵育20～24 h。转染前1 h换液。 （2）按照下属方法制备磷酸钙-DNA沉淀：于5 ml灭 ...

在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。 1、克隆 选用合适 的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果 ...

CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 一、CHO细胞表达系统 1、优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降 ...

体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工 、修饰。真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。 1、杆状病毒的生物学特性 杆状病毒只来源于无脊 ...

按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因 ...

自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就 。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟 ...

ayao0问：前几天学习做细胞脂质体转染 看师姐是用的加血清的培养基，整个过程比以前的方法简单方便了很多 不用过四个小时就去换液，可以过了48个小时看转染效率很不好，以前也有人用这种方法做过，很成功。 到底这种新的方法行不行的通，做的时候需要注意哪些问题 丁香园网友kikie认为： 用的是invitrogen的lipofectamine2000，说明书上明确说可以用含血清的培养基： Prepare ...

pazj：我的细胞转染48h后在荧光显微镜观察，细胞形态还正常，消化传代以后加G418做稳转，加药以后头两天看，细胞形态还是正常的，但是第三天开始就缩小成小圆点了，感觉就和加胰酶消化后的细胞形态，不知道这个时候细胞是死是活？我还要继续加药吗？还是重新做转染？ 丁香园网友lanniaoxxx认为： 这种情况应该是细胞死亡的形态表现。建议仔细回想步骤，并查找文献，重新做转染 丁香园网友wlnju认为： ...

bioangelwx15问： 本人刚做慢病毒赶染实验，有些问题还不懂，想请教下大家，病毒感染细胞时是不是只要病毒的量够就行了呢？是不是病毒滴度大就少加病毒液，滴度小就多加呢？当然，前提是我要保证感染的细胞有充足的氧气供应，即使病毒液多加也有氧气供应，只是我不知道病毒浓度大小对感染细胞的效率有影响么？也就是说当病毒总量一定，病毒滴度大感染时加的量少和病毒滴度小，感染时加的量大，感染效率会不会一样呢？ ...

问： 有些细胞生长周期很长（如83hours），如果转入诱导其凋亡的质粒后，生长会更慢，细胞数目会更少，这类细胞用什么方法比较容易得到稳定细胞株？希望有经验的战友给予帮助，非常感谢！ 答： 如果你转入的是有诱导凋亡的基因，那么这时是得不到稳定细胞株的。建议你改用诱导表达型的载体，先筛选得到稳定的细胞株，然后在实验的过程中，当你需要激活基因表达时，只需要加入诱导剂（比如强力霉素等），这时你就可以观察 ...

问： 最近做细胞转染，预筛选稳定克隆，载体为pEGFP-N1，pIERS 现在是平行做几个基因，转然后，只有空载体和一个基因可以看到绿色荧光，其余均没有，这会是什么原因呢？怎么补救啊？ 答： 需要考虑的问题有： 1.你的细胞和转染的方法，是不是你的细胞本身就很难转染，有些细胞用脂质体转染率很低的。在求助时最好告知细胞和具体的转染方法和试剂。 2.质粒的纯度和质量：看你使用那种试剂盒提取的，我们的经 ...

qdshlyykqk： 我最近对肿瘤细胞转染GFP，其中不含有其他外源性基因。转染后短期内发现阳性细胞非常多，可是随着时间及细胞的增殖，培养孔内的细胞总数在不断的增加，但是发绿色荧光的细胞反而较以前少了（培养液中一直加着G418）。另外，转染后进行有限稀释单克隆的筛选，筛出来的单细胞长成克隆（大约1周）是发光的，但到两周的时候，荧光却消失了。请问这是什么原因？如果我想筛选出整合到宿主细胞染色体中的 ...

maoliping70：pEGFP-N1为载体表达的核蛋白要确证表达于核内的方法为用PI染色，PI只与核酸结合，在488nm激发下发红光，而GFP发绿光，红光与绿光重叠发黄光。还有以下疑问： 1.作为对照的pEGFP-N1空载体转染细胞后表达的GFP蛋白为27KD，能自由通过核孔复合体，也就是说GFP在核内也有表达，那会与PI重叠发黄光影响测定吗？ 2.有提出GFP在细胞固定时，会从细胞漏出，那细 ...

feiqi：最近我从别人处拿到一种稳定转染的细胞，他让我用G418稳定细胞系，但是我不知道我所拿到的细胞是否真的稳定转染了我所需要基因，怎么进行鉴定？谢谢！ 丁香园网友kevinfong认为： 第一，看看是不是G418抗性的。第二，采用Western检测你所需的基因是否表达，但必需和内源性的比较，如果这个细胞本身不表达你的目的基因那就不需要比较了。第三，你也可以提基因组做PCR看目的基因是否整合， ...

wangcaixia1： 我是第一次做蛋白表达，所表达的蛋白是以包涵体形式存在的，包涵体经过洗涤、溶解后进行复性，采用不同尿素浓度（4.5、3.5、2.5、1.5、0.5、0）的复性缓冲液进行复性，我想请教的问题是这一系列不同尿素浓度的复性缓冲液可以重复使用吗？如果是不同的蛋白可以重复使用吗？ 丁香园网友panmo2006认为： 不知道你用的是哪一种表达载体，如果是融合表达载体pGEX时候，在透析 ...

问： 我要用6孔板作蚀斑减少试验，但是琼脂dmem加到孔里，还没加完6个空，杯子里的就已经凝固了，琼脂和dmem都是在50度水浴里的，混合后赶紧加，但是来不及。有什么办法能很舒服的加进孔里去又不凝的太快吗？ 答： 做蚀斑减少试验最关键的就是铺胶时动作即要缓慢，以防止气泡产生同时动作要快，一般六孔板加2-3毫升就够了，你可以用10毫升的吸管吸够10毫升可以加四格孔，在50度水浴里化开的琼脂完全可以加 ...

问：神经干细胞nestin和EphrinA4的免疫荧光双标怎么做？ 答： 过程和一般的免疫染色一样就是封闭的时候用两种血清混合封闭1：1 加入一抗和二抗的时候也是混合加入 但是因为稀释浓度不好掌握最好提前作预试~ 补充一点，荧光双标记必须选择的一抗抗性不同，如一个是兔多抗，一个是鼠单抗，那么二抗分别采用抗兔，抗鼠的不同颜色标记的荧光二抗即可。 ...